1、什么是微生物？

所謂微生物是指個體微小，必須借助于顯微鏡才能看清它們外形的一群低等的、原始的微小生物，如細(xì)菌。

2、微生物特點(diǎn)

·微生物是結(jié)構(gòu)簡單、繁殖快、分布廣、個體最小的生物；

·結(jié)構(gòu)簡單：微生物多數(shù)是單細(xì)胞,有的具有細(xì)胞構(gòu)造，有的甚至沒有細(xì)胞構(gòu)造；

·生長旺，繁殖快（大腸桿菌在它的適宜37-44℃之間，20-30分鐘繁殖一代）；

·分布廣.種類多（10萬多種） ：自然界中到處都有，如水、空氣、土壤等；

·個體小：小于0.1mm，肉眼不可見；

·適應(yīng)性強(qiáng)，易變異；

·代謝強(qiáng)，轉(zhuǎn)化快。

3、微生物分類

·真核細(xì)胞型微生物——細(xì)胞核分化程度高，有核膜和核仁，細(xì)胞器完整。如真菌。 

·原核細(xì)胞型微生物——細(xì)胞核的分化較低，僅有原始核，無核膜、核仁。細(xì)胞器很不完善。DNA和RNA同時存在。這類微生物眾多，有細(xì)菌、放線菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體。 

·非細(xì)胞型微生物——是最小的微生物一類微生物。無典型的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，只能在活細(xì)胞內(nèi)生長繁殖。核酸類型為DNA或RNA。病毒屬之。

4、微生物實驗室常規(guī)儀器設(shè)備

·電子天平：0.1g；0.01g；

·pH計；

·加熱裝置：電爐、微波爐；

·高壓滅菌鍋

·高壓鍋滅菌檢測產(chǎn)品

  1、壓力滅菌指示卡（121℃）；

  2、生物指示劑（121℃，15min ）

·干燥滅菌箱

·水浴鍋

·超凈工作臺/生物安全柜

（1）區(qū)別：保護(hù)對象不同

·操作臺內(nèi)的滅菌設(shè)備

*酒精燈；

*紅外線滅菌器；

*電子火焰滅菌器；

·培養(yǎng)箱

*一般恒溫培養(yǎng)箱；

*厭氧培養(yǎng)箱（厭氧培養(yǎng)罐）

二、微生物檢測

1、常用標(biāo)準(zhǔn)

GB 4789.2-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定；

GB 4789.3-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數(shù)；

GB 4789.15-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)；

GB 4789.4-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗；

GB 4789.10-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗；

GB 4789.30-2016 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗；

2、菌落總數(shù)測定

菌落總數(shù)（aerobic plate count）

食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間等）培養(yǎng)后，所得每mL(g)檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。

衛(wèi)生學(xué)意義：

·食品的菌落總數(shù)嚴(yán)重超標(biāo)，說明其產(chǎn)品的衛(wèi)生狀況達(dá)不到基本的衛(wèi)生要求。

·加工、貯存運(yùn)輸過程中是否受到污染——衛(wèi)生質(zhì)量

·衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)：菌落總數(shù)和致病菌有本質(zhì)區(qū)別，必須配合其他病原菌項目的檢驗，才能作出比較全面準(zhǔn)確的評定。

計數(shù)和報告-結(jié)果報告

注意事項：

★必須做空白對照：監(jiān)測培養(yǎng)基、平皿、稀釋液的無菌程度。同時，應(yīng)在工作臺內(nèi)打開一塊空白PCA（其暴露時間應(yīng)與檢樣時間相當(dāng)），以了解樣品在檢驗過程中有無受到來自環(huán)境的污染。

★水浴和傾注溫度：46℃±1℃。

★培養(yǎng)條件：一般樣品36℃±1℃/48h±2h，水產(chǎn)品（指原生態(tài)、未加工水產(chǎn)品）30℃±1℃/72h±3h。

★如樣品（干調(diào)、面粉、脫水蔬菜）中可能含有在瓊脂表面蔓延生長的菌落，可在凝固后的瓊脂表面再覆蓋一層（4mL）培養(yǎng)基。

★樣品稀釋液有時會帶有細(xì)碎的食物顆粒（如奶粉、堅果），為避免這些顆粒與菌落發(fā)生混淆，可將樣品稀釋液與PCA混合，單做培養(yǎng)，置于4℃冰箱放置同樣時間，以便在計數(shù)時作為對照。

3、大腸菌群測定

（1）定義：在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。

該菌主要來源于人畜糞便，作為糞便污染指標(biāo)評價食品的衛(wèi)生狀況，推斷食品中腸道致病菌污染的可能。

這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致。根據(jù)進(jìn)一步的生化鑒定試驗，可將大腸菌群細(xì)分為大腸埃希氏菌（俗稱大腸桿菌）、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。

（2）檢驗原理：

MPN法：是統(tǒng)計學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合的一種定量檢測法。待測樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后，根據(jù)其未生長的最低稀釋度與生長的最高稀釋度，應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數(shù)。

平板計數(shù)法：大腸軍群在固體培養(yǎng)基中發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，在指示劑的作用下形成可計數(shù)的紅色或紫色，帶有或不帶有沉淀環(huán)的菌落

4、霉菌酵母計數(shù)

培養(yǎng)基的使用：

▲兩種培養(yǎng)基都含有氯霉素，可以抑制細(xì)菌的生長；

▲對氯霉素耐藥的一些細(xì)菌在這兩種培養(yǎng)基上也會生長，可以通過菌落形態(tài)來區(qū)分，或者通過染色鏡檢來判定；

▲如果需要分開報告霉菌和酵母菌的數(shù)量，主要通過菌落形態(tài)來區(qū)分。

細(xì)菌、酵母菌及霉菌的不同菌落形態(tài)：

細(xì)菌：由于細(xì)胞小，形成的菌落較小，較薄、較透明、且有“細(xì)膩感”�？僧a(chǎn)生不同色素，菌落可呈現(xiàn)五顏六色且形態(tài)多樣。

酵母菌：由于細(xì)胞較大且不能運(yùn)動，一般菌落比細(xì)菌大、厚且透明度差。產(chǎn)生色素較單一，通常乳白色，少數(shù)為橙紅色，個別黑色。

霉菌：菌落形態(tài)較大，質(zhì)地疏松，外觀干燥，不透明，呈現(xiàn)蛛網(wǎng)狀、絨毛狀、棉絮狀或氈狀；菌落與培養(yǎng)基間的聯(lián)系緊密，不易挑起，菌落正面與反面、邊緣與中心的顏色和構(gòu)造常不一致。

細(xì)菌、酵母菌及霉菌的鏡檢形態(tài)。

細(xì)菌：包括三種基本形態(tài)，球狀、桿狀和螺旋狀。

酵母菌：細(xì)胞通常有球狀、卵圓狀、橢圓狀、柱狀和香腸狀。

霉菌：細(xì)胞構(gòu)造與酵母菌相似，但以菌絲體形式存在。

4、致病菌檢驗

（1）選擇性分離

分別用3mm接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個XLD瓊脂平板（或HE瓊脂平板或沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板），于36℃±1℃分別培養(yǎng)18h～24h（XLD、HE、顯色培養(yǎng)基）或40h～48h（BS瓊脂平板）

為了最大可能的檢出沙門氏菌，必須使用兩種或以上選擇性分離培養(yǎng)基。

（2）生化鑒定

（3）血清學(xué)鑒定

▲血清學(xué)作為鑒定的一部分，必須完成;

▲實驗室必須配備沙門氏菌的自凝性、多價菌體（Ｏ）和多價鞭毛（Ｈ）診斷血清;

▲其中血清學(xué)分型為選作試驗項目;

▲血清學(xué)試驗必須基于生化試驗的結(jié)果，不能單純以血清學(xué)實驗結(jié)果來報告最終結(jié)果。

（4）自凝性檢查及O多價鑒定

三、菌種保藏

1、挑選特征典型的純菌菌落

2、確定保藏的合適菌體形態(tài)

3、選擇最適宜的保藏方法

4、定期對保藏菌種進(jìn)行檢查

磁珠保藏菌種方法：

刮取新鮮純培養(yǎng)物，配置3-4麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙骸?/span>

加入到保存管中，擰緊，來回顛倒4-5次，磁珠會吸附菌體，然后將培養(yǎng)液吸取干凈置于-20℃或-70℃，或液氮中保存。