荷蘭的DSM公司生產(chǎn)的試劑盒開發(fā)于50年代，目前已成為全球公認的乳品抗生素殘留的檢測方法，是荷蘭、法國等國家乳品抗生素殘留的標準檢測方法。微生物抑制試驗的原理是基于對微生物生理學和代謝抗生素的抑制作用，可以定性確定樣品中的抗生素殘留是否超過標準。試劑盒是利用微生物抑制法原理，在96孔檢測板的微孔中加入含嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢和pH指示劑的培養(yǎng)基，在 60-65℃條件下培養(yǎng)，指示劑由紫色變?yōu)辄S色。

實驗部分：

1、儀器和試劑

設備：超凈工作臺、pH測試計、電子天平、滅菌鍋、干式加熱器、磁力攪拌器、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡。試劑：蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、葡萄糖、溴甲酚紫、氫氧化鈉、屈臣氏無菌蒸餾水、不同種抗生素標準品、無抗奶樣。

2、實驗方法

（1）抗生素樣本的制備選擇無抗奶，按照表1所示，添加不同濃度抗生素制成模擬樣本。

（2）芽孢萌發(fā)條件及試劑盒參數(shù)的優(yōu)化芽孢可以保持很長的休眠時間，也可以在外界刺激下打破休眠而萌發(fā)成營養(yǎng)體快速生長。通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分、pH、菌株包埋含量、培養(yǎng)溫度等以促進孢子萌發(fā)，并篩選變色靈敏的顯色劑，來提高試劑盒檢出靈敏度。

根據(jù)查閱資料，設置基礎培養(yǎng)基配比為蛋白胨0.5%，葡萄糖0.3%，瓊脂1.5%，CMC 0.1%；選擇溴甲酚紫為顯色劑，pH7.0，包埋量為1×l07 CFU/mL，罐裝量100 μL/孔，在此條件下進行優(yōu)化。目標是在加樣本后2.5-3 h反應內(nèi)，可以檢測出目標抗生素。檢出限參考Delvotest®試劑盒。

設置4種培養(yǎng)基，將活化好的菌株接種到配置好的培養(yǎng)基上，65℃培養(yǎng)8 h后，開始每隔2 h觀察每個培養(yǎng)基上菌落大小來判斷菌落的生長速度；將培養(yǎng)基罐裝到微孔板中，在65℃下孵育3 h，根據(jù)培養(yǎng)基變色的時間來判斷產(chǎn)酸效果，確定最佳培養(yǎng)基成分配比。4種培養(yǎng)基設置如下：1：蛋白胨0.5%、葡萄糖0.3%、瓊脂1.5%；2：蛋白胨1.0%、葡萄糖0.3%、瓊脂1.0%；3：蛋白胨1.0%、葡萄糖0.5%、瓊脂0.5%、CMC 0.2%；4：蛋白胨1.5%、葡萄糖0.5%、瓊脂0.5%、CMC 0.1%；

芽孢包埋濃度設置為：1×l07CFU/mL，pH7.0，按照100 μL/孔罐裝，分別加入100 μL無抗奶及表如3-1所示的加標奶，65℃下孵育3h測試靈敏度。溴甲酚紫含量設置：20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L。

包埋濃度分別設置為：1×l05CFU/mL、1×l06CFU/mL、1×l07CFU/mL、1×l08CFU/mL、1Xl09CFU/mL 。按照100 μL/孔罐裝好試劑盒，分別加入100 μL無抗奶及各種濃度的加標奶，在65℃下孵育3 h，觀看顏色變化，以抗生素檢測靈敏度（考慮最接近國標檢出限）來確定芽孢包埋最佳濃度。

（3）試劑盒靈敏度的測定根據(jù)3.2優(yōu)化后參數(shù)，生產(chǎn)一批試劑盒，進行靈敏度測定實驗。根據(jù)3.1配置待檢測奶樣，添加100 μL奶樣至微孔中，在65℃下孵育3 h，判斷試劑盒靈敏度范圍。

3、結(jié)果與分析

（1）包埋培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的確定依照包埋培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的優(yōu)化的實驗方案，培養(yǎng)基各種成分配比實驗結(jié)果如表2、表3所示。

注：－代表沒有長菌，＋代表長菌，＋越多代表菌體數(shù)目和大小越好

由表2、表3所示，在相同的時間內(nèi)，以菌落生長的數(shù)目和狀態(tài)反應菌株的生長速度；產(chǎn)酸效率反應菌落生長等速度，最佳包埋培養(yǎng)基成分為蛋白胨1.0%、葡萄糖0.5%、瓊脂0.5%、CMC 0.2%。

（2）顯色劑含量的確定依照包埋顯色劑的優(yōu)化的實驗方案，結(jié)果如表4、表5所示。

注:“+”表示黃色、“－”表示紫色、“±”表示半黃半紫色

注:“+”表示陽性、“－”表陰性、“±”表示弱陽性指示劑的添加量對包埋培養(yǎng)基顏色變化有一定的影響。隨著溴甲酚紫含量的提高，檢測變色效果逐漸提高，靈敏度提高，但要綜合考慮到國標對抗生素殘留檢出限的要求，由表4、表5所示， 綜合變色時間和檢測靈敏度兩個因素，判斷溴甲酚紫最佳含量為40 mg/L。

（3）芽孢包埋濃度的確定依照芽孢包埋濃度的優(yōu)化的實驗方案，在相同的包埋培養(yǎng)基中加入不同含量菌液，制備試劑盒，進行抗生素檢測實驗，結(jié)果如表6和圖1所示。

注：“+”表示陽性、“-”表示陰性、“±”表示弱陽性 

圖1 不同濃度青霉素檢測結(jié)果

由表6所示，在一定范圍內(nèi)，隨著芽孢包埋量的增加，對5種抗生素的檢測靈敏度不斷提高，也逐漸趨于穩(wěn)定，綜合考慮靈敏度效果和國標檢出限要求，最佳芽孢包埋量為在1×l07CFU/mL 。

（4）試劑盒檢測限的確定以蛋白胨1.0 %、葡萄糖0.5 %、瓊脂0.5 %、CMC 0.2 %，甲酚紫含量40 mg/L、pH7.0，芽孢包埋量1×l07CFU/mL ，罐裝量為130 μL/孔，小試生產(chǎn)一批試劑盒，根據(jù)3.1配置待檢測奶樣，添加100 μL奶樣至微孔中，在65 ℃下孵育3 h，判斷試劑盒靈敏度范圍，結(jié)果如表7和圖2所示。

注:“+”表示陽性、“－”表示陰性、“±”表示弱陽性

圖2 

5種不同抗生素檢測結(jié)果由表7和圖2所示，經(jīng)過條件優(yōu)化，初步測定試劑盒的檢出限，分別是青霉素2 μg/L、磺胺嘧啶100 μg/L、強力霉素150 μg/L、林可霉素150μg/L、頭孢氨芐100 μg/L。跟Devotest®試劑盒無顯著差異。

4、結(jié)論與討論

本文主要對芽孢萌發(fā)培養(yǎng)基成分、指示劑、pH、芽孢包埋量、罐裝量等影響芽孢萌發(fā)產(chǎn)酸條件等進行優(yōu)化，最終確定最佳條件為：蛋白胨1.0%、葡萄糖0.5％ 、瓊脂0.5%、CMC 0.2%，溴甲酚紫含量40 mg/L、pH7.0，芽孢包埋量1×l07CFU/mL，罐裝量為130 μL/孔。

通過對五大類抗生素添加樣檢測，初步確定試劑盒的靈敏度，根據(jù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試劑盒可以檢測出5大類抗生素，但靈敏度還需要提高，對5大類抗生素包涵的其它小類還需要進一步進行驗證，確定不同種抗生素的檢測范圍。