蛋白質(zhì)是牛奶的主要成分，且牛奶中的蛋白質(zhì)是完全的蛋白質(zhì)，由于含有人體必需的氨基酸，所以營養(yǎng)價值很高，牛奶中的蛋白質(zhì)消化率可以達(dá)到90%～100%。乳中其他含氮物主要來源于乳中的氨、尿素、肌酸、肌酸酐、尿酸、乳清酸、多肽、馬尿酸、氨基酸和其他成分,這些成分構(gòu)成了非蛋白質(zhì)氮。

真蛋白(true protein,TP)即真正的蛋白質(zhì),在測定方面可定義為除了非蛋白質(zhì)氮以外的蛋白態(tài)氮所計(jì)算得到的蛋白,正常情況下,天然乳中真蛋白的含量少于粗蛋白。酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白質(zhì),主要以膠束狀態(tài)存在于乳中,它是以含磷蛋白質(zhì)為主體的幾種蛋白質(zhì)的復(fù)合體,主要分為αs12酪蛋白、αs22酪蛋白、β2酪蛋白和κ2酪蛋白4種。一般情況下,乳品真蛋白中約有80%為酪蛋白,但其含量因個體差異、牧場管理、乳牛品種的不同而變化。

牛奶及乳制品中含有豐富的蛋白質(zhì)，但在牛奶收購、生產(chǎn)環(huán)節(jié)中，質(zhì)量摻假事件時有發(fā)生，尤以“劣質(zhì)假奶粉”事件和“三聚氰胺奶粉”事件為甚。目前，乳制品的消費(fèi)量很大，根據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，世界人均年消費(fèi)乳制品46kg，是日常飲食結(jié)構(gòu)的重要組成部分，它的安全性直接影響到人們的身體健康，所以一旦出現(xiàn)質(zhì)量或安全問題，它暴露的受害人群和風(fēng)險(xiǎn)就會高一些。尤其牛奶對嬰幼兒有代母乳的作用，在嬰兒成長的特定階段，成為其全部營養(yǎng)來源，因而，乳制品的安全至關(guān)重要，世界各國都對乳制品的質(zhì)量控制制定了相當(dāng)嚴(yán)密的標(biāo)準(zhǔn)體系。

目前檢測蛋白質(zhì)的國家標(biāo)準(zhǔn)方法是凱氏定氮法，其結(jié)果只是氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而不是真正意義上的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。這種缺陷造成某些不法分子對牛奶進(jìn)行摻假，添加硫酸銨、三聚氰胺、水解植物或動物蛋白等含氮物質(zhì)。要杜絕這類問題，必須建立真蛋白質(zhì)的檢測方法。

1、電位滴定法

基本原理為：蛋白質(zhì)的兩端有游離的具有酸性的羧基（－COOH）和堿性的氨基（－NH2），當(dāng)加入甲醛溶液時，氨基上的兩個氫原子被次甲基所取代，于是便失去了氨基的堿性特性，從而使其呈酸性的羧基釋放出來，使溶液的電化學(xué)特性發(fā)生變化。再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定游離的羧基（－COOH），從而用經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算其蛋白質(zhì)含量。

與凱式定氮法相比，該法可以排除三聚氰胺、尿素對牛乳中蛋白質(zhì)測定的干擾，其次該方法所需檢測儀器及試劑常規(guī)，操作簡便，而且大大縮短了測定時間，提高了工作效率，具有一定的推廣使用價值。但從其原理中不難得出此法不能排除銨態(tài)氮（氯化銨、硫酸銨、碳酸銨等）的干擾，有一定的局限性。針對這一漏洞唐英偉等人在2009年提出了改進(jìn)方法即：在測定前在試樣中加入濃堿液加熱檢查有無氨氣放出，驗(yàn)證有無銨態(tài)氮。若有，則先將銨態(tài)氮分離出去，再用電位滴定法測定；若沒有，則可直接用電位滴定法測定。

2、三氯乙酸-雙縮脲比色法該方法的基本原理為：采用150g/L的三氯乙酸溶液(在混合物中的最終濃度約為120g/L )沉淀乳中的蛋白質(zhì),用過濾法分離沉淀和溶液,沉淀部分含蛋白態(tài)氮,非沉淀部分(溶液)含非蛋白態(tài)氮。將濾渣收集起來,再用雙縮脲法進(jìn)行定氮。即可得出樣品中的真蛋白含量。三氯乙酸-雙縮脲比色法可以較好地檢測出乳中的真蛋白。

該方法是對凱式定氮法的改進(jìn)，在樣品檢測前先將其中的蛋白質(zhì)沉淀，可以很好的排除三聚氰胺、尿素等非蛋白氮的干擾。后期采用雙縮脲法對濾渣進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定，且操作簡便迅速，可提高工作效率，但靈敏度比較低,測定范圍為1～20mg蛋白質(zhì),適用于精度要求不高的蛋白質(zhì)含量測定。

3、紫外分光光度法紫外分光光度法的基本原理為：蛋白質(zhì)中含帶共軛雙鍵的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基,使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì),其吸收峰在280 nm 處,吸光度與蛋白質(zhì)含量成線性關(guān)系,因此,通過測蛋白質(zhì)溶液的吸光度,即可測得樣品中蛋白質(zhì)的含量。該方法測得蛋白質(zhì)量濃度的回收率在94.0%～106.7%之間，通過精密度實(shí)驗(yàn)，得到相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.06%。結(jié)果表明，紫外分光光度法檢測真蛋白質(zhì)量濃度與其他3種檢測方法差異不顯著；且檢測結(jié)果不受人為添加非蛋白類含氮物質(zhì)的影響。

紫外分光光度法檢測生鮮牛乳真蛋白質(zhì)量濃度，方法快速、可行，非蛋白態(tài)氮不能計(jì)入蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，可以有效防止不法分子以含氮有機(jī)物冒充蛋白質(zhì)的違法行徑。

4、考馬斯亮藍(lán)G-250法考馬斯亮藍(lán)法是由考馬斯亮藍(lán)G-250染料與蛋白質(zhì)通過范德華引力結(jié)合,使蛋白質(zhì)染色,通過比色測定蛋白質(zhì)含量的方法。該方法精密度高,RSD為1.70%, 結(jié)果準(zhǔn)確, 相對誤差較小, 回收率98.2%～100.3%。

考馬斯亮藍(lán)G-250 與蛋白質(zhì)結(jié)合的反應(yīng)十分迅速且穩(wěn)定,這一方法具有靈敏度高、干擾物質(zhì)少、測定快速、簡便等優(yōu)點(diǎn),不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、絡(luò)合劑的影響,適合大量樣品的測定，可推廣到其他乳制品及保健食品、植物蛋白飲料等中的蛋白質(zhì)測定。但由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差。

5、凝膠柱層析——考馬斯亮藍(lán)染色法考馬斯亮藍(lán)染色測定蛋白質(zhì)是一種經(jīng)典的方法，但按傳統(tǒng)方法配成的顯色劑卻存在著溶解不完全、比色池上極易沉積等問題，實(shí)際操作時對測定的準(zhǔn)確性干擾較大。為此2010年張弘等人對考馬斯亮藍(lán)顯色劑中進(jìn)行了改良，加入了大分子的醇類和酚類物質(zhì)，新研制的顯色劑溶液溶解度好，比色池上沉積很少，且穩(wěn)定，存放一年不影響測定。此外還研發(fā)出了牛奶蛋白質(zhì)快速檢測儀，該儀器體積小、操作簡便、檢測速度快、靈敏度高，且能有效消除添加的三聚氰胺、尿素、硫酸銨等無機(jī)氮，及水解植物和動物蛋白等小分子多肽氮對牛奶中蛋白質(zhì)檢測的干擾，從而能從根本上杜絕牛奶中摻假蛋白檢測題，可用于現(xiàn)場牛奶真蛋白質(zhì)快速檢測。結(jié)果表明，牛奶中蛋白質(zhì)分子量絕大部分集中分布在1×104～7×104u以上和1×104u以下分子量的蛋白質(zhì)所占的比例很小。綜合應(yīng)用牛奶中蛋白質(zhì)的分子量分布特征和考馬斯亮藍(lán)染色法的特性研發(fā)出。

該法通過對考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行改良，基于馬斯亮藍(lán)染色法的特性和牛奶中蛋白質(zhì)分子量的分布特征研制出牛奶蛋白質(zhì)快速檢測儀。分子量約1 ku以上含氮物中的肽鏈和考馬斯亮藍(lán)結(jié)合，在波長595nm處達(dá)到最大吸收值。牛奶中的蛋白質(zhì)主要是酪蛋白和清蛋白兩大類，它們的分子量大多在1×104～3×104u；蛋白質(zhì)分離檢測儀檢測的結(jié)果表明：牛奶中的蛋白質(zhì)分子量集中分布在1×104～7×104u，和考馬斯亮藍(lán)的顯色作用非常明顯，因此靈敏度很高。牛奶中的其他物質(zhì)，如脂肪、多糖、維生素等均不與考馬斯亮藍(lán)作用，摻假物質(zhì)，如三聚氰胺、尿素和硫酸銨等基本也不顯色，因此能有效識別；而水解植物和動物蛋白中，大部分是小分子肽，只有很少一部分的大分子蛋白質(zhì)才能顯色，但如果要達(dá)到和牛奶相同的顯色值，含氮量要達(dá)到牛奶的20倍左右才能做到，因此，用牛奶蛋白質(zhì)快速檢測儀測定蛋白質(zhì)，可有效地防止牛奶中摻假蛋白質(zhì)的干擾，從而能從根本上杜絕牛奶中摻假蛋白的檢測問題，可用于現(xiàn)場牛奶真蛋白質(zhì)的快速檢測。

6、毛細(xì)管電泳法電泳是指在電場作用下,帶電粒子向著與其所帶電荷電性相反的電極移動的現(xiàn)象。電泳法,就是指帶電荷的供試品(如蛋白質(zhì)、核苷酸等) 在惰性支持介質(zhì)(如濾紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等) 中,在電場的作用下,向其對應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動,由于各組分之間的移動速度不同,使各組分分離成狹窄的區(qū)帶,并用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其百分含量的方法。

毛細(xì)管電泳法也稱高效毛細(xì)管電泳法,它是近十幾年發(fā)展起來的一項(xiàng)新的分析方法,結(jié)合了電泳和色譜兩大技術(shù)。

Miralles等人用CE法對乳中變性的β2乳球蛋白和對位2κ2酪蛋白進(jìn)行了分離和定量測定,并研究了pH值、尿素濃度、檸檬酸濃度、電壓等因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響,結(jié)果表明該法可在30 min完成乳制品中變性β2乳球蛋白和對位2κ2酪蛋白的定量檢測。但是由于該法使用的儀器昂貴、操作較為復(fù)雜,在一定程度上限制了它的應(yīng)用范圍。

7、紅外光譜分析法近紅外光譜是介于可見光(VIS)和中紅外光(MIR 或IR)之間的電磁波, 美國材料檢測協(xié)會(ASTM)將近紅外光譜區(qū)定義為波長780～2526nm的光譜區(qū)。通過分子振動、轉(zhuǎn)動的狀態(tài)變化在不同能級間產(chǎn)生躍遷,當(dāng)其能量與近紅外光譜區(qū)內(nèi)某一波長處光子的能量相當(dāng)時,可產(chǎn)生近紅外光譜吸收。食品中蛋白質(zhì)和多肽在這個波段的特征吸收可以用來測定蛋白質(zhì)的含量。

近紅外光譜技術(shù)的主要特點(diǎn)有:分析速度快、分析效率高、適用的樣品范圍廣,對樣品無損傷等。已廣泛應(yīng)用于谷物、乳類、肉類、烘焙類、豆類蛋白質(zhì)的分析測定中,但儀器價格昂貴,靈敏度相對較低。

8、數(shù)字圖像法該方法是基于雙縮脲反應(yīng)原理, 通過一次性采集標(biāo)樣和試樣乳粉處理液的圖像信息,得出試樣乳粉的蛋白質(zhì)含量。

王旭等人利用凱氏定氮法和數(shù)字圖像法測定添加了不同NPN的乳粉蛋白質(zhì)含量, 分析非蛋白態(tài)氮對凱氏定氮法和數(shù)字圖像法測定乳粉蛋白質(zhì)含量的影響。結(jié)果表明，對于沒有人為添加非蛋白態(tài)氮的乳粉來說, 用凱氏定氮法和數(shù)字圖像法測定結(jié)果具有較好的一致性。當(dāng)乳粉中含有大量NPN時, 凱氏定氮法測得的粗蛋白含量無法體現(xiàn)蛋白質(zhì)的真實(shí)情況。一旦乳粉中惡意添加大量非蛋白態(tài)氮,采用數(shù)字圖像法測定蛋白質(zhì)含量, 其結(jié)果不受干擾。數(shù)字圖像法大體上可以看作針對真蛋白質(zhì)特有的反應(yīng), 非蛋白態(tài)含氮物質(zhì)對測定結(jié)果沒有影響, 測定乳粉中的真蛋白含量具有較高的準(zhǔn)確性。

9、直讀法蛋白質(zhì)分子凝聚從溶液中析出的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)沉淀(spancipitation),變性蛋白質(zhì)一般易于沉淀,但也可不變性而使蛋白質(zhì)沉淀。引起蛋白質(zhì)沉淀的主要方法有鹽析、重金屬鹽沉淀、生物堿試劑以及某些酸類沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、加熱凝固等。吳敏等人通過對生鮮牛乳進(jìn)行脫脂和水浴加熱后,加入蛋白質(zhì)沉淀劑、離心分離得到蛋白質(zhì)沉淀,直接根據(jù)沉淀體積讀取出牛乳中蛋白質(zhì)含量。結(jié)果表明，在置信度大于90%時,置信區(qū)間為(8.72±0.43),RSD為4.75%,此方法作為一種快速測量牛乳中蛋白質(zhì)的方法,可廣泛用于各個奶站和奶廠收奶,也可用于質(zhì)檢部門進(jìn)行快速檢測,結(jié)果快速,比較準(zhǔn)確,費(fèi)時較短且成本低廉,不失為一種優(yōu)良的快速檢測方法。

10、Udy染料染色法Udy染料染色法采用蛋白與一定pH的橙酸12染料結(jié)合的原理測定乳中的氨基酸,如精氮酸、組氨酸和賴氨酸,其中蛋白質(zhì)的多肽長度須在5個氨基酸以上。其紅色的色澤隨蛋白的含量增加,即結(jié)合的越多而減退,即色澤的強(qiáng)弱與蛋白的濃度呈反比,因此只要在一定的波長下測定其色澤的程度,即可計(jì)算得到真蛋白的濃度。用Udy染色法測定牛奶樣品中的真蛋白含量只需不到1 min的時間,1967年,該法得到AOAC認(rèn)可。

由于中國國家標(biāo)準(zhǔn)中乳品蛋白質(zhì)檢測方法的缺陷,出現(xiàn)摻加尿素、銨肥甚至三聚氰胺等氮含量高的有機(jī)物來提高“蛋白質(zhì)含量”的違法操作,嚴(yán)重制約了我國乳制品的質(zhì)量提升,影響了消費(fèi)者的身體健康。近幾年來，關(guān)于乳品中真蛋白的檢測方法的研究也比較多，其中不乏有許多操作簡便、對設(shè)備要求不高、檢測時間短，靈敏度較高的方法，如直讀法、數(shù)字圖像法、紫外分光光度法、三氯乙酸——雙縮脲法等。這些方法的研究對規(guī)范我國乳品中關(guān)于真蛋白的檢測具有推動作用，為進(jìn)一步提升乳品質(zhì)量做出了貢獻(xiàn)。