一、適用范圍

本方法適用于生活飲用水及其水源水、地表水、污水、廢水等水中糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）的定性檢測、定量檢測。

二、方法原理

固定底物酶底物法（DST）采用大腸菌群細(xì)菌能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶分解ONPG使培養(yǎng)液呈黃色的原理，來判斷水樣中是否含糞大腸菌群（耐熱大腸菌群），糞大腸的培養(yǎng)溫度是44.5℃。

三、儀器設(shè)備

1、程控定量封口機(jī)

2、電熱恒溫培養(yǎng)箱

3、冰箱

4、51孔定量盤、97孔定量盤

5、100ml無菌水樣瓶

6、高壓蒸汽滅菌鍋

7、干熱滅菌器

8、量筒

9、吸管

10、試管

四、培養(yǎng)基和試劑

1、科立得（固定底物技術(shù)酶底物法）檢測試劑：MMO-MUG培養(yǎng)基。

2、無菌水

五、樣品的采集和保存

1、采樣前準(zhǔn)備

采樣瓶：采用IDEXX公司科立得 系統(tǒng)配套的滅菌100毫升消毒帶刻度容器。

2、樣品采樣及注意事項(xiàng)

（1）將已滅菌和封包好的采樣瓶，無論在什么條件下采樣時(shí)，均要小心開啟包封紙和瓶蓋，避免瓶蓋及瓶子頸部受雜菌污染，并注意在使用船只或附帶的采樣繩等附加設(shè)備采樣時(shí)可能造成的污染。

（2）在采集江、河、湖、庫、地表水樣時(shí)，可握住瓶子底部直接將采樣瓶插入水中，約距水面10~15厘米處，瓶口朝來水方向，使水樣灌入瓶內(nèi)。如果沒有水流，可握住瓶子水平前推，直至充滿水樣為止。采好樣后，迅速蓋上瓶蓋和包裝紙。采樣后，采樣瓶內(nèi)上部應(yīng)留有一些空隙，以便檢驗(yàn)前充分混勻水樣。

（3）用采樣器采樣時(shí)，將無菌的水樣瓶放入架內(nèi)。將采樣裝置放入水中。到達(dá)預(yù)定深度后，打開瓶塞，待水樣灌好后，松開瓶塞的軟繩，蓋上瓶蓋。再將整個(gè)裝置提出水面。

（4）從自來水龍頭采集樣品時(shí)，不要選用漏水的龍頭，采水前可先將水龍頭用酒精燈火焰灼燒滅菌或用70%的酒精溶液消毒水龍頭及采樣瓶口，然后將水龍頭完全打開，放水?dāng)?shù)分鐘后除去水管中的滯留雜質(zhì)。采水時(shí)控制水流速度小心接入瓶內(nèi)。

（5）在同一采樣點(diǎn)進(jìn)行分層采樣時(shí)，應(yīng)自上向下進(jìn)行，以免不同層次的攪擾；同一采樣點(diǎn)與理化監(jiān)測項(xiàng)目同時(shí)采樣時(shí)，應(yīng)先采集細(xì)菌等檢驗(yàn)樣品，否則樣品可能被污染，采樣前，不得用水樣刷洗采樣瓶。

（6）采樣完畢，應(yīng)將采樣瓶編號、作好采樣記錄。將記錄下采樣條件，填入采樣表格內(nèi)。

（7）樣品的運(yùn)輸和保存：采好的水樣，應(yīng)迅速運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)，一般從取樣到檢驗(yàn)不宜超過2小時(shí)，不然應(yīng)使用10℃以下的冷藏設(shè)備保存樣品，但不得超過6小時(shí)，實(shí)驗(yàn)室接到送檢樣后，應(yīng)將樣品立即放入冰箱，并在2小時(shí)內(nèi)著手檢驗(yàn)。如果因路途遙遠(yuǎn)，送檢時(shí)間超過6小時(shí)者，則應(yīng)考慮現(xiàn)場檢驗(yàn)。

3、樣品交接

樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，由采樣人員與質(zhì)管科樣品管理人員進(jìn)行交接。雙方需對樣品名稱、編號、樣品采集點(diǎn)名稱、采樣時(shí)間、數(shù)量、采樣人簽名等進(jìn)行登記核實(shí)。如在驗(yàn)收過程中，發(fā)現(xiàn)編號錯亂、字跡不清、規(guī)格不符、監(jiān)測項(xiàng)目不明及采樣不合要求者，可拒收并建議補(bǔ)采。如無法補(bǔ)采，應(yīng)經(jīng)領(lǐng)導(dǎo)批準(zhǔn)，方可收樣測定。樣品管理人員收樣后應(yīng)盡快轉(zhuǎn)交檢測人員以便及時(shí)進(jìn)行分析。

4、干擾與消除：

防止操作過程中的污染，嚴(yán)格無菌操作。

六、操作步驟

1、水樣稀釋

檢測所需水樣為100mL。若水樣污染嚴(yán)重，可對水樣進(jìn)行稀釋。取10 mL水樣加入到90 mL無菌水中，必要時(shí)可加大稀釋度，水樣按照10倍逐級稀釋。

2、定性反應(yīng)

用100 mL的無菌稀釋瓶量取100 mL水樣，加入科立得培養(yǎng)基粉末，混搖均勻使之完全溶解后，放入44.5℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。

3、51孔定量盤法

（1）用100mL的無菌稀釋瓶量取100mL水樣，加入科立得培養(yǎng)基粉末，混搖均勻使之完全溶解。

（2）將前述100mL水樣全部倒入51孔無菌定量盤內(nèi)，以手撫平定量盤背面以趕除孔穴內(nèi)氣泡，然后用程控定量封口機(jī)封口。放入44.5℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。

（3）無需稀釋檢測范圍：1-200MPN/100mL糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）

4、97孔定量盤法

（1）將100mL水樣全部倒入97孔無菌定量盤內(nèi)，其余步驟與6.3.1、6.3.2條款相同。

（2）無需稀釋檢測范圍：1-2419MPN/100mL糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）

七、結(jié)果報(bào)告

1、結(jié)果觀察與報(bào)告

（1）結(jié)果判讀

將水樣培養(yǎng)24h后進(jìn)行結(jié)果判讀，如果結(jié)果為可疑陽性，可延長培養(yǎng)時(shí)間到28h進(jìn)行結(jié)果判讀，超過28h之后出現(xiàn)的顏色反應(yīng)不作為陽性結(jié)果。

（2）定性反應(yīng)

水樣經(jīng)24h培養(yǎng)之后如果顏色變成黃色，判斷為陽性反應(yīng)，表示水中含有糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）。水樣顏色未發(fā)生變化，判斷為陰性反應(yīng)。定性反應(yīng)結(jié)果以糞大腸菌群檢出或未檢出報(bào)告。

（3）51孔定量盤法、97孔定量盤法

①將培養(yǎng)24h的水樣的定量盤取出觀察，如果顏色變成黃色則表示定量盤孔中含有糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）。若無法明顯辨別黃色孔格，則可借助97孔陽性比色盤比色判讀。檢測結(jié)果說明如下：

②計(jì)算有陽性反應(yīng)的孔穴數(shù)，對照附表1：51孔定量盤MPN表或者附表2：97孔定量盤MPN表查出代表的糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）最可能數(shù)。結(jié)果以MPN/100mL表示。如所有孔未產(chǎn)生黃色，則可報(bào)告為糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）未檢出。

③在無需稀釋檢測范圍內(nèi)直接可讀出結(jié)果。若水中糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）污染嚴(yán)重，超出定量范圍（全部孔格顯黃色）則需要稀釋，讀取結(jié)果后再乘以稀釋倍數(shù)。

八、質(zhì)控

每批科立得試劑需做驗(yàn)證檢驗(yàn)：向一份100mL無菌水樣中接種含有糞大腸菌的質(zhì)控樣標(biāo)準(zhǔn)菌株，按照上述定量檢測步驟操作觀察結(jié)果，看結(jié)果是否在其范圍內(nèi)。

九、注意事項(xiàng)

1、如果水樣品有背景顏色，需做一個(gè)空白試驗(yàn)，與科立得標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果相比較。

2、只可使用滅菌水，不含緩沖液的水，不含氧化劑的水進(jìn)行樣品稀釋。

3、此法所用試劑只用于常規(guī)水樣，不可用于濃縮水樣。

4、如水樣中含有過多的氯，則加入科立得試劑可能顯藍(lán)光，則該水樣不可用此方法。

5、此法無需在無菌室中進(jìn)行，但操作過程因避免微生物污染。

6、檢測使用過的定量盤應(yīng)滅菌后棄去。把約30個(gè)定量盤放入防爆袋中，用繩子松松的扎住袋口，放入高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃高壓滅菌20min后取出，在防爆袋上注明“生物垃圾已滅菌”方可棄去。

附表1：51孔定量盤MPN表

附表2：97孔定量盤MPN表