線粒體功能和穩(wěn)態(tài)的打破也會(huì)引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)、心臟和肌肉的疾病。一般認(rèn)為，細(xì)胞衰老與老年性疾病如神經(jīng)退行性疾病、心腦血管疾病、糖尿病及腫瘤等關(guān)聯(lián)緊密，而線粒體則通過調(diào)控細(xì)胞衰老而影響衰老相關(guān)疾病。

由于線粒體以及ROS在生理和病理過程中都起著重要作用。不同的ROS，例如超氧化物（O 2 •-），過氧化氫和過氧亞硝酸鹽（ONOO •-），會(huì)刺激不同的細(xì)胞信號(hào)通路，并根據(jù)其數(shù)量和亞細(xì)胞定位而導(dǎo)致不同的結(jié)果�，F(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)出了多種用于檢測線粒體和ROS的方法，這不僅有助于線粒體相關(guān)的科學(xué)研究也有助于臨床診斷線粒體疾病。

目前對(duì)線粒體的檢測方法有線粒體基因組測序、呼吸控制法、線粒體ATP生成率、膜電位等方法，此外，通過電子顯微鏡還可以直接觀察線粒體的形態(tài)、數(shù)量變化。

1、線粒體基因組檢測技術(shù)

傳統(tǒng)的線粒體測序是基于Sanger法測序，利用線粒體特有的序列進(jìn)行PCR，然后進(jìn)行Sanger法測序，得到序列后與標(biāo)準(zhǔn)序列比較，這種方法由于通量低價(jià)格也相對(duì)較低，適用于線粒體遺傳病的篩查。但是，由于一個(gè)細(xì)胞中線粒體數(shù)量龐大，這種方法無法精確檢查線粒體突變的情況，于是引入了高通量測序（NGS）。

高通量測序靈敏度高，非常適合檢測線粒體的異質(zhì)性、多態(tài)性，識(shí)別導(dǎo)致線粒體疾病的點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變、倒位突變、重復(fù)突變等基因結(jié)構(gòu)的改變。所以線粒體異常疾病的直接診斷策略為高通量測序技術(shù)直接檢出致病基因的突變。

2、線粒體氧化呼吸鏈檢測

此項(xiàng)檢測技術(shù)主要有傳統(tǒng)的線粒體功能檢測、用Seahorse檢測線粒體功能和細(xì)胞代謝和線粒體基因組衰老水平的檢測技術(shù)等。

（1）傳統(tǒng)的線粒體功能檢測：

線粒體呼吸控制率（RCR）、ATP生成率和膜電位的檢測都是通過電化學(xué)的方法，以評(píng)價(jià)線粒體結(jié)構(gòu)和功能完整性以及氧化磷酸化效率的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。RCR檢測既可以反映線粒體的完整程度，也可以反應(yīng)氧化磷酸化效率，RCR等于由ADP磷酸化時(shí)的耗氧量除以ADP用完后的耗氧量。

一般需要提前分離完整的線粒體，在密閉環(huán)境下利用氧電極法檢測。正常線粒體的RCR為3至10：RCR降低意味著線粒體ATP合成功能損傷，呼吸障礙；RCR增高意味著細(xì)胞活動(dòng)旺盛，代謝加快。線粒體ATP生成率（MAPR）檢測也是評(píng)價(jià)線粒體完整性和功能的重要指標(biāo)。

此方法是利用重組熒光素酶與ATP反應(yīng)后根據(jù)激發(fā)熒光來檢測ATP的生成率。膜電位的檢測利用線粒體JC-1試劑盒，通過JC-1在線粒體內(nèi)聚集（紅色熒光）或散布在buffer中并未聚集（綠色熒光）來顯示線粒體的膜電位變化，也可以直接通過膜片鉗技術(shù)，實(shí)時(shí)的記錄細(xì)胞膜上單一的或者多個(gè)離子通道活動(dòng)。

（2）用Seahorse檢測線粒體功能和細(xì)胞代謝：

Seahorse細(xì)胞能量代謝分析儀是檢測線粒體功能和細(xì)胞代謝的有力工具，可以實(shí)時(shí)且不需要任何染料或標(biāo)記物的非侵入性方式測量線粒體呼吸和糖酵解。Seahorse檢測時(shí)將細(xì)胞培養(yǎng)在專用的微孔板上，實(shí)時(shí)檢測加入不同藥物后線粒體功能與糖酵解的

關(guān)鍵參數(shù)：基礎(chǔ)呼吸，ATP生成，質(zhì)子漏，最大呼吸值，能量儲(chǔ)備能力，糖酵解能力，糖酵解能量儲(chǔ)備能力。儀器系統(tǒng)會(huì)發(fā)射激光，并測量激發(fā)熒光的變化。瞬態(tài)微腔所形成的很小的體積允許實(shí)時(shí)、靈敏、精確且無損地測量參數(shù)。自動(dòng)計(jì)算氧氣濃度和pH的變化，并以耗氧率（OCR）和細(xì)胞外酸化率（ECAR）為結(jié)果。

3、線粒體基因組衰老水平的檢測技術(shù)

除了線粒體直接導(dǎo)致的疾病，線粒體的基因組、生理生化水平也會(huì)隨著年齡的增長發(fā)生變化。通常認(rèn)為與年齡相關(guān)的體細(xì)胞mtDNA突變是由于損傷而產(chǎn)生的，這種損傷和突變?cè)谒ダ线^程中逐漸積累，并伴隨著線粒體形態(tài)變化的出現(xiàn)。這一理論得到了大量相關(guān)數(shù)據(jù)的支持，這些數(shù)據(jù)顯示，老年人中的體細(xì)胞mtDNA突變水平高于年輕人。

人的體細(xì)胞通常包含數(shù)千個(gè)mtDNA拷貝，mtDNA的復(fù)制與細(xì)胞周期無關(guān)，因此特定的mtDNA分子可以在細(xì)胞分裂時(shí)復(fù)制很多次。此外，單個(gè)細(xì)胞經(jīng)常包含一種以上基因型的mtDNA，這種情況稱為異質(zhì)性。在致病性突變的異質(zhì)性情況下，突變的mtDNA的比例將決定是否發(fā)生線粒體功能障礙。突變的mtDNA損害功能時(shí)的閾值水平通常很高，但也取決于突變的類型和位置。

體細(xì)胞線粒體DNA突變水平的測量技術(shù)上比較復(fù)雜，尚無對(duì)于單個(gè)非擴(kuò)增mtDNA進(jìn)行測序的標(biāo)準(zhǔn)方法，因此所有可用的方案均涉及PCR和/或克隆。因此，新技術(shù)的應(yīng)用主要還是通過PCR擴(kuò)增，然后再針對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測或者測序。針對(duì)mtDNA大片段缺失，可以通過定量PCR的方法，如果存在突變量高于總量的5%，則可以通過Southern blot來檢測。針對(duì)mtDNA全局點(diǎn)突變的檢測，主要是通過高通量測序得到大量的序列數(shù)據(jù)，通過生物信息算法去除PCR錯(cuò)誤和測序錯(cuò)誤，最后得到線粒體的全局點(diǎn)突變，并以此來計(jì)算線粒體異質(zhì)性。由于線粒體異質(zhì)性與衰老以及遺傳選擇性有密切關(guān)系，以此來計(jì)算個(gè)體或組織的衰老程度。

4、線粒體健康指數(shù)的評(píng)估

2014年，Balu Chacko等提出了生物能源健康指數(shù)（BHI）的概念，以檢測血液白細(xì)胞的線粒體功能為核心，以綜合評(píng)價(jià)目標(biāo)個(gè)體的生物能功能障礙。BHI指數(shù)轉(zhuǎn)化生物學(xué)的重要結(jié)果。2018年，新的研究簡化了指數(shù)檢測的內(nèi)容，整合了核DNA和線粒體DNA編碼的呼吸鏈酶活性和線粒體DNA拷貝數(shù)，提出了線粒體健康指數(shù)（MHI）。

該方法定量檢測了檸檬酸合酶（CS），細(xì)胞色素C氧化酶（COX，complex IV）和琥珀酸脫氫酶（SDH，complex II）的酶活性, 并進(jìn)行了mtDNA和核DNA計(jì)數(shù)以歸一化單個(gè)細(xì)胞中的線粒體數(shù)目。這項(xiàng)研究指出MHI可以反映出人的日常情緒和壓力狀態(tài)。