當(dāng)前所在頁(yè)面：大腸菌群(Coliform bacteria)是指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。該菌主要來(lái)源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中是否有污染腸道致病菌的可能。大腸菌群分布較廣，在溫血?jiǎng)游锛S便和自然界中廣泛存在。
調(diào)查研究表明，大腸菌群多存在于溫血?jiǎng)游锛S便、人類經(jīng)�；顒�(dòng)的場(chǎng)所以及有糞便污染的地方。人、畜糞便對(duì)外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因之一，糞便中多以典型大腸桿菌為主，而外界環(huán)境中則大腸菌群的其他菌株較多。
一、檢測(cè)方法
大腸菌群檢測(cè)的關(guān)鍵在于方法的選用，食品中大腸菌群檢測(cè)有兩種表示方法，其一是以100mL(g)檢樣內(nèi)大腸菌群最大可能數(shù)(MPN)表示，檢測(cè)方法需使用GB/T 4789.3-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群測(cè)定》；
其二以每g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值表示，檢測(cè)方法需使用GB 4789.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》。GB/T 4789.3-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群測(cè)定》雖然被后更新的方法代替，但衛(wèi)生部關(guān)于規(guī)范食品中大腸菌群指標(biāo)的檢測(cè)工作公告(2009年 第16號(hào))明確指出，為規(guī)范食品中大腸菌群指標(biāo)的檢測(cè)工作公告如下：
現(xiàn)行食品標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的大腸菌群指標(biāo)以“MPN/100克或MPN/100毫升”為單位的，適用《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群測(cè)定》(GB/T 4789.3-2003)進(jìn)行檢測(cè)；
以“MPN/克或MPN/毫升”、“CFU/克或CFU/毫升”為單位的，適用《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》(GB/4789.3-2016)進(jìn)行檢測(cè)。
例如，GB/T2717-2003醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)大腸菌群的要求需使用方法一GB/T 4789.3-2003。又如GB/T 2718-2014醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)大腸菌群的要求需使用方法二GB4789.3-2016。
MPN檢索表使用：GB/T 4789.3-2003檢索表中陽(yáng)性管數(shù)是以1mL(g)×3、0.1mL(g)×3和0.01mL(g)×3的梯度進(jìn)行表示，GB 4789.3-2016陽(yáng)性管數(shù)是以0.10、0.01和0.001的梯度表示,均按照稀釋倍數(shù)推算結(jié)果，結(jié)果相同。推算方法以GB 4789.3-2016為例，改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍;如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)時(shí),則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高10倍,其余類推即可。
二、常用標(biāo)準(zhǔn)
1、 GB/T 4789.3-2003 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群測(cè)定；
2、GB 4789.3-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)；
3、GB 4789.28-2013 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求；
4、GB 4789.1-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 總則；
5、GB 4789.41-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 腸桿科檢驗(yàn)；
6、GB/T 27405-2008 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品微生物檢測(cè)7、GB/T 16294-2010 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)） 沉降菌的測(cè)試方法。
三、常見(jiàn)問(wèn)題及解答
1、食品中大腸菌群的檢測(cè)有兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)三種方法，該如何選擇呢？
A：依據(jù)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的項(xiàng)目單位
若單位為CFU/g，則選擇GB 4789.3-2016第二法（平板計(jì)數(shù)法）
若單位為MPN/g，則選擇GB 4789.3-2016第一法（MPN計(jì)數(shù)法）
若單位為MPN/100g，則選擇GB/T 4789.3-2003。
2、MPN法3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度該怎樣選擇？A：依據(jù)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)值
若標(biāo)準(zhǔn)值為＜3.0MPN/g，則選擇0.1g、0.01g、0.001g三個(gè)稀釋度。
若標(biāo)準(zhǔn)值為≤30MPN/100g，則選擇1g、0.1g、0.01g三個(gè)稀釋度。
四、樣品采集
怎樣采樣，才能使樣品具有代表性？
這里將樣品分為兩類：預(yù)包裝食品和散裝食品或現(xiàn)場(chǎng)制作食品：
1、對(duì)于預(yù)包裝食品
①應(yīng)采集相同批次、獨(dú)立包裝、適量件數(shù)的食品樣品，每件樣品的采樣量應(yīng)滿足微生物項(xiàng)目檢驗(yàn)的要求。
②獨(dú)立包裝小于、等于1000g 的固態(tài)食品或小于、等于1000mL 的液態(tài)食品，取相同批次的包裝。
③獨(dú)立包裝大于1000mL 的液態(tài)食品，應(yīng)在采樣前搖動(dòng)或用無(wú)菌棒攪拌液體，使其達(dá)到均質(zhì)后采集適量樣品，放入同一個(gè)無(wú)菌采樣容器內(nèi)作為一件食品樣品；大于1000g 的固態(tài)食品，應(yīng)用無(wú)菌采樣器從同一包裝的不同部位分別采取適量樣品，放入同一個(gè)無(wú)菌采樣容器內(nèi)作為一件食品樣品。
2、對(duì)于散裝食品或現(xiàn)場(chǎng)制作食品用無(wú)菌采樣工具從n個(gè)不同部位現(xiàn)場(chǎng)采集樣品，放入n個(gè)無(wú)菌采樣容器內(nèi)作為n件食品樣品。每件樣品的采樣量應(yīng)滿足微生物項(xiàng)目檢驗(yàn)單位的要求。怎樣采樣，才能使樣品具有代表性？
這里將樣品分為兩類：預(yù)包裝食品和散裝食品或現(xiàn)場(chǎng)制作食品。
1、對(duì)于預(yù)包裝食品
①應(yīng)采集相同批次、獨(dú)立包裝、適量件數(shù)的食品樣品，每件樣品的采樣量應(yīng)滿足微生物項(xiàng)目檢驗(yàn)的要求。
②獨(dú)立包裝小于、等于1000g的固態(tài)食品或小于、等于1000mL的液態(tài)食品，取相同批次的包裝。
③獨(dú)立包裝大于1000mL的液態(tài)食品，應(yīng)在采樣前搖動(dòng)或用無(wú)菌棒攪拌液體，使其達(dá)到均質(zhì)后采集適量樣品，放入同一個(gè)無(wú)菌采樣容器內(nèi)作為一件食品樣品；大于1000g的固態(tài)食品，應(yīng)用無(wú)菌采樣器從同一包裝的不同部位分別采取適量樣品，放入同一個(gè)無(wú)菌采樣容器內(nèi)作為一件食品樣品。
2、對(duì)于散裝食品或現(xiàn)場(chǎng)制作食品用無(wú)菌采樣工具從n個(gè)不同部位現(xiàn)場(chǎng)采集樣品，放入n個(gè)無(wú)菌采樣容器內(nèi)作為n件食品樣品。每件樣品的采樣量應(yīng)滿足微生物項(xiàng)目檢驗(yàn)單位的要求。
五、培養(yǎng)基制備過(guò)程容易出現(xiàn)問(wèn)題解答
1、異�，F(xiàn)象一：培養(yǎng)基不凝固
原因分析：
①制備過(guò)程中過(guò)度加熱；
②低pH造成培養(yǎng)基酸解；
③稱量不正確；
④瓊脂未完全溶解；
⑤培養(yǎng)基成分未充分混勻。
2、異�，F(xiàn)象二：pH不正確
原因分析：
①制備過(guò)程中過(guò)度加熱；
②水質(zhì)不佳；
③外部化學(xué)物質(zhì)污染；
④測(cè)定pH時(shí)溫度不正確；
⑤pH計(jì)未正確校準(zhǔn)；
⑥脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差。
3、異�，F(xiàn)象三：顏色異常
原因分析：
①制備過(guò)程中過(guò)度加熱；
②水質(zhì)不佳；
③pH不正確；
④外來(lái)污染；
⑤脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差。
4、異�，F(xiàn)象四：產(chǎn)生沉淀
原因分析：
①制備過(guò)程中過(guò)度加熱；
②水質(zhì)不佳；
③脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差；
④pH計(jì)未正確控制。
5、異�，F(xiàn)象五：培養(yǎng)基出現(xiàn)抑制/低的生長(zhǎng)率
原因分析：
①制備過(guò)程中過(guò)度加熱；
②脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差；
③水質(zhì)不佳；
④使用成分不正確，如：成分稱量不準(zhǔn)，添加劑濃度不正確；
⑤制備容器或水中的有毒殘留物。
6、異常現(xiàn)象六：選擇性差
原因分析：
①制備過(guò)程中過(guò)度加熱；
②脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差；
③配方使用不對(duì)；
④添加成分的加入不正確，例如加入添加成分時(shí)培養(yǎng)基過(guò)熱或添加濃度錯(cuò)誤；
⑤添加劑污染。
7、異�，F(xiàn)象七：污染
原因分析：
①不適當(dāng)?shù)臏缇?/span>
②無(wú)菌操作技術(shù)存在問(wèn)題；
③添加劑污染。
六、實(shí)驗(yàn)過(guò)程
1、2016版平板法VRBA傾注完，待瓊脂凝固后為什么需要加3-4mL的覆蓋層？
A：因?yàn)榇竽c菌群是需氧及兼性厭氧的，再加一層瓊脂相當(dāng)于造就一個(gè)半?yún)捬醐h(huán)境，促進(jìn)兼性厭氧菌的生長(zhǎng)，同時(shí)抑制其他菌的生長(zhǎng)。除此之外，還有防止菌落蔓延的作用，防止遷徙性菌落對(duì)菌落計(jì)數(shù)構(gòu)成影響。例如一些變形桿菌就會(huì)有遷徙現(xiàn)象，從而導(dǎo)致菌落長(zhǎng)成一片無(wú)法區(qū)分。在表面多覆蓋一層培養(yǎng)基就可以避免這種情況的發(fā)生。
2、GB 4789.3-2016平板法驗(yàn)證菌落如何挑取？
A：分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落數(shù)。按比例挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落,少于10個(gè)菌落的挑取全部典型和可疑菌落。假如在1:10的平板上可疑大腸菌群有10個(gè)，典型大腸菌群有6個(gè)。證實(shí)實(shí)驗(yàn)應(yīng)該按照可疑跟典型5:3的比例進(jìn)行挑取，移種于BGLB肉湯管內(nèi)。
七、結(jié)果處理
1、所有稀釋度都不在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)怎么辦？
這種情況一般都是最低稀釋度的平板都小于15CFU，這種情況就是以最低稀釋度的平板菌落數(shù)乘以驗(yàn)證試驗(yàn)的比例來(lái)計(jì)算。例如10倍稀釋的兩個(gè)平板上菌落數(shù)分別為10、8，菌落數(shù)為10的平皿挑取10個(gè)菌落復(fù)發(fā)酵中有8個(gè)菌落產(chǎn)氣，菌落數(shù)為8的平皿挑取8個(gè)菌落復(fù)發(fā)酵中有7個(gè)菌落產(chǎn)氣，則計(jì)算過(guò)程是這樣的：(10*8/10+8*7/8)/2*10=75CFU/g（mL）。
2、連續(xù)兩個(gè)稀釋度的四個(gè)平皿的菌落數(shù)都在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)怎么辦？
這個(gè)需要參考菌落總數(shù)檢測(cè)國(guó)標(biāo)里7.1.2里的公式計(jì)算。我們需要先計(jì)算每個(gè)平皿的驗(yàn)證后的菌落數(shù)，再代入公式計(jì)算即可。例如10倍稀釋度兩個(gè)平皿菌落數(shù)為120和125,100倍稀釋度兩個(gè)平皿的菌落數(shù)為17和16，經(jīng)過(guò)復(fù)發(fā)酵驗(yàn)證產(chǎn)氣的管數(shù)分別為7、8、8、8，則我們先計(jì)算每個(gè)平皿上的菌落數(shù)分別為120*7/10=84,125*8/10=100,17*8/10=13.6（我們計(jì)14），16*8/10=12.8（我們計(jì)13），然后將84、100、14、13四個(gè)數(shù)代入公式：（84+100+14+13）/（2+0.2）*10=959，結(jié)果應(yīng)報(bào)告960CFU/g（mL）。
3、只有一個(gè)稀釋度的一個(gè)平皿的菌落數(shù)在計(jì)數(shù)范圍，其他均不在計(jì)數(shù)范圍怎么辦？
這樣我們只需要復(fù)發(fā)酵驗(yàn)證這一個(gè)平皿即可，根據(jù)這一個(gè)平皿的菌落數(shù)進(jìn)行報(bào)告。例如10倍稀釋度兩個(gè)平皿菌落數(shù)為160和142,100倍稀釋度兩個(gè)平皿的菌落數(shù)為12和13，則我們只需要從菌落數(shù)為142CFU的平皿里挑取10個(gè)菌落進(jìn)行復(fù)發(fā)酵驗(yàn)證即可，假如共有7支發(fā)酵管陽(yáng)性，則應(yīng)計(jì)算142*7/10=99.4，結(jié)果報(bào)告990CFU/g（mL）。
注意：對(duì)于結(jié)果檢出的平板或試管需要經(jīng)過(guò)無(wú)害化處理（121℃滅菌30分鐘）方能棄去，防止對(duì)環(huán)境造成污染。
