對(duì)藥物雜質(zhì)研究時(shí)引入“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)( Quality byDesign，QbD)”的理念，可在藥物生產(chǎn)之前根據(jù)具體工藝的合成機(jī)制、起始物料及各中間體的基本結(jié)構(gòu)，初步勾畫出產(chǎn)品的雜質(zhì)譜。

雜質(zhì)來源分析是制定藥物雜質(zhì)控制策略的基礎(chǔ)，尤其是在對(duì)毒性雜質(zhì)來源分析時(shí)，應(yīng)分析所有合成和生產(chǎn)工藝中的試劑、中間體、副產(chǎn)物，推測(cè)可能產(chǎn)生的潛在雜質(zhì)以及分析實(shí)際存在的雜質(zhì)。

在原料藥合成結(jié)束后，藥物的活性化合物雖然經(jīng)過毒性分析已不含有“警示結(jié)構(gòu)”(alerting structure)，但是在生產(chǎn)過程中使用到含有警示結(jié)構(gòu)的化合物則還需考慮其遺傳毒性。

雜質(zhì)的前處理是伴隨著藥物活性成分前處理而存在的，然而藥物中雜質(zhì)的含量低且其結(jié)構(gòu)與主成分差異較大，因此常規(guī)藥物活性成分的前處理和檢測(cè)方法(如初始流動(dòng)相溶解后直接進(jìn)行 HPLC-UV 分析)并不一定適用于藥物雜質(zhì)，應(yīng)針對(duì)不同的樣品選擇不同的前處理技術(shù)。

對(duì)檢測(cè)靈敏度低的樣品通常使用衍生化的前處理方式，比如引入生色團(tuán)產(chǎn)生紫外響應(yīng)，或增加易離子化基團(tuán)增加離子化效率等。

雖然常規(guī)衍生化方式能夠滿足日常檢測(cè)的需求，但是為了實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度的基因雜質(zhì)進(jìn)行快速篩選和定量，可對(duì)傳統(tǒng)的衍生化試劑進(jìn)行改變以增加其專屬性和靈敏度，也可使用氣-固衍生化來彌補(bǔ)液-固衍生化的不足。

低濃度雜質(zhì)前處理方法的選擇根據(jù)其雜質(zhì)類型所決定，如降解產(chǎn)物利用強(qiáng)制降解等方法提高降解物的濃度等，但是常規(guī)的降解方法往往會(huì)引入其他雜質(zhì)，因而會(huì)干擾特殊雜質(zhì)的雜質(zhì)譜研究，為了得到單一的雜質(zhì)研究機(jī)制，Ueya-ma 等提出了一種新型的固體藥物氧化降解平臺(tái)，該平臺(tái)排除了常見氧化方式(例如 H2O2 主導(dǎo))引起的水解、溶劑解或熱效應(yīng)等，可用于氧化降解機(jī)制的特異性研究。

不同儀器有不同的使用條件，因此對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行前處理工作能夠延長儀器的使用壽命，例如質(zhì)譜檢測(cè)器不能使用含有非揮發(fā)性鹽的流動(dòng)相，因此在建立液質(zhì)聯(lián)用條件時(shí)可利用二維液相色譜技術(shù)在第一維將各峰進(jìn)行分離并將樣品保留至樣品環(huán)中，第二維液相使用質(zhì)譜可接受的流動(dòng)相以及脫鹽柱來洗脫樣品環(huán)中的樣品從而實(shí)現(xiàn)了被分析物“脫鹽”來保護(hù)質(zhì)譜。

雜質(zhì)在藥物中含量較低，利用直接測(cè)定法無法實(shí)現(xiàn)雜質(zhì)的定性定量分析。因此，應(yīng)對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行分離以獲取雜質(zhì)的單一成分，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)雜質(zhì)的檢測(cè)。近年來，液相色譜技術(shù)以及超臨界流體技術(shù)發(fā)展較為迅速。

高效液相色譜技術(shù)(HPLC) HPLC 作為最傳統(tǒng)的方法在雜質(zhì)分離中仍然使用得最多。通過各種色譜柱技術(shù)以及聯(lián)用技術(shù)能夠?qū)�絕大多數(shù)化合物實(shí)現(xiàn)分離、分析。為了解決與紫外檢測(cè)器聯(lián)用靈敏度低的問題，新型二維 高 效 液 相 色 譜 (2D-HPLC)利用了液相色譜技術(shù)分離和富集的特點(diǎn)提高了對(duì)低濃度雜質(zhì)的檢測(cè)能力。

目前，HPLC 無論采用正相洗脫還是反相洗脫都需消耗大量的有機(jī)溶劑，這對(duì)環(huán)境帶來較大的污染，因此提出以水或其他環(huán)境友好的試劑為主要洗脫溶劑的新型液相色譜技術(shù)正得到廣泛的研究。超高效液相色譜技術(shù)(UHPLC) 為了應(yīng)對(duì)藥物研發(fā)的需要，UHPLC 作為一種快速分離的色譜技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)在各種藥物的開發(fā)上。

Dong 等根據(jù)UHPLC 的使用方法，討論了如何針對(duì)不同樣品建立穩(wěn)定的UHPLC方法。手性分離方面，UHPLC目前并沒有大量小于2μm 粒徑的商品化手性色譜柱，但是利用傳統(tǒng)的手性流動(dòng)相添加法也可實(shí)現(xiàn)對(duì)手性雜質(zhì)進(jìn)行分離。

在實(shí)驗(yàn)室建設(shè)方面，分析實(shí)驗(yàn)室目前仍以 HPLC 為主要研究儀器，但為了獲得類似于UHPLC 分離效能，許多科研工作者通過優(yōu)化 HPLC系統(tǒng)同時(shí)使用核殼型色譜柱實(shí)現(xiàn)了快速分離。

以液態(tài)CO2 為主要流動(dòng)相的SFC 技術(shù)，由于其與紫外聯(lián)用檢測(cè)靈敏度低，其發(fā)展一直非常緩慢，但質(zhì)譜檢測(cè)器(MS)的普及以及環(huán)境友好型社會(huì)的需要，使 SFC 能用于分離手性雜質(zhì)。雖然 SFC 與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)用于雜質(zhì)分析已有相關(guān)報(bào)道 ，但商品化的 SFC-MS聯(lián)用儀器并未大量出現(xiàn)。

為實(shí)現(xiàn)對(duì)雜質(zhì)的定量及定性分析，需要獲取高純度單一成分的雜質(zhì)，然而雜質(zhì)在藥物中含量較低，利用分析型液相色譜技術(shù)制備雜質(zhì)需要消耗大量時(shí)間，利用制備型液相色譜技術(shù)等方法可提高高純度雜質(zhì)的獲取速度，加快雜質(zhì)研究工作。

經(jīng)純化的雜質(zhì)可獲得更高質(zhì)量的圖譜，但藥物中雜質(zhì)含量低的問題一直制約著雜質(zhì)單體的獲取速度。利用液質(zhì)聯(lián)用方法可獲得雜質(zhì)的來源與簡單結(jié)構(gòu)，再利用強(qiáng)制降解 、結(jié)晶母液或直接合成等方式可制備出雜質(zhì)單體制備技術(shù)上。

為了克服常規(guī)一維制備型液相色譜技術(shù)以及制備型SFC 色譜技術(shù)的方法建立困難、制備時(shí)間較長等缺點(diǎn)而提出制備型的二維液相色譜技術(shù)(Prep 2D-LC)以及二維 SFC 色譜技術(shù)已得到越來越多的應(yīng)用。

Zhang 等提出了一種新型的 Prep 2D-LC，該儀器首先通過一維液相色譜對(duì)樣品進(jìn)行初步分離，并用質(zhì)譜相對(duì)分子質(zhì)量監(jiān)控和中心切割的方式將目標(biāo)物保存在樣品環(huán)(Sample loop)中，再利用在柱洗脫(at column dilution)的方法將樣品環(huán)中的樣品進(jìn)樣至第二維液相色譜中，第二維液相色譜通過使用與第一維相同或者不同的流動(dòng)相對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步分離同時(shí)使用質(zhì)譜監(jiān)控方法即可得到更高純度的目標(biāo)物。

這種新方法不僅替代了一維制備型液相色譜，同時(shí)解決了傳統(tǒng)制備2D-LC 系統(tǒng)高壓以及峰展寬的問題。類似于2D-LC，該課題組也提出了2D-SFC 制備技術(shù)以用于手性和非手性化合物的篩選 。

（2）其他制備技術(shù)

藥物中雜質(zhì)含量低，利用液固吸附分離的方式會(huì)造成雜質(zhì)損失，延長制備時(shí)間。逆流色譜技術(shù) ( counter-current chromatogra-phy，CCC)通過液液萃取方式使雜質(zhì)吸附達(dá)到最低，樣品重現(xiàn)性能夠達(dá)到 100%，而且有報(bào)道將制備液相色譜技術(shù)和 CCC 進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明 CCC對(duì)溶解度低的樣品的上樣能力和高通量能力都優(yōu)于制備液相色譜。

與 CCC 類似的離心分配色(centrifugal partition chromatography，CPC)，利用流體靜力分配方式實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的純化作用，但CPC 在使用中會(huì)出現(xiàn)固定相流失以及流速不穩(wěn)定脈沖的問題，Amarouche 等 通過引入順流洗脫(co-current elution)方法解決了上述問題并成功地對(duì)不溶性環(huán)孢素 A 進(jìn)行了純化。

為了實(shí)現(xiàn)快速制備與純化，通過空氣加壓加速液固分離的快速質(zhì)譜(flash chromatography，F(xiàn)C)也不失為一種大量制備化合物的方法。

4、雜質(zhì)檢測(cè)技術(shù)

雖然 HPLC-UV 技術(shù)可對(duì)大部分藥物雜質(zhì)進(jìn)行定量分析，但由于紫外檢測(cè)靈敏度低而無法實(shí)現(xiàn)對(duì)極微量雜質(zhì)的準(zhǔn)確定量。然而，質(zhì)譜技術(shù)擁有高靈敏度和高分辨率等優(yōu)點(diǎn)，近年來由于其具有卓越的定量和定性分析能力已得到了快速的發(fā)展。同時(shí)，減少樣品消耗量也是不斷推動(dòng)核磁共振技術(shù)的發(fā)展動(dòng)力之一。

（1）質(zhì)譜技術(shù)(MS)

定量分析：質(zhì)譜技術(shù)可作為紫外無響應(yīng)雜質(zhì)的一種替代定量手段，同時(shí)因其具有較高的檢測(cè)靈敏度，能夠?qū)ψ贤鈫尾ㄩL檢測(cè)無法定量的痕量雜質(zhì)得以準(zhǔn)確測(cè)定。但在對(duì)某些特殊雜質(zhì)測(cè)定時(shí)，由于離子化能力弱仍需要通過衍生化或在流動(dòng)相加入堿金屬離子等方法以獲取質(zhì)譜響應(yīng) 。

常規(guī) MS檢測(cè)器由于分辨率的制約導(dǎo)致對(duì)痕量雜質(zhì)的定量準(zhǔn)確性不高，而高分辨率質(zhì)譜(HRMS)能將被分析物的荷質(zhì)比(m/z)檢測(cè)相對(duì)誤差降到1×10^-6~2×10^-6，在選擇離子掃描定量中提高了對(duì)痕量分析物的定量準(zhǔn)確度。

HRMS高分辨率的另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是質(zhì)量區(qū)分更為準(zhǔn)確，這可用于區(qū)分相對(duì)分子質(zhì)量相近的多種化合物，利用此優(yōu)勢(shì)和 UHPLC聯(lián)用能在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)多種雜質(zhì)的分離定量 。

結(jié)構(gòu)鑒定：對(duì)雜質(zhì)單體進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定耗時(shí)長，因此在藥物的雜質(zhì)譜分析中使用液質(zhì)聯(lián)用的方法可對(duì)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行快速鑒定。該方法是以一級(jí)質(zhì)譜確定的分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜碎裂分析。

然而，質(zhì)譜分辨率的不足常使母離子的 m/z 判斷不準(zhǔn)，從而造成雜質(zhì)的元素組成不明確，同時(shí)二級(jí)碎片信息量不足也阻礙了對(duì)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步解析。因此，HRMS、多級(jí)質(zhì)譜(MS n )以及氫/氘(H/D)交換等技術(shù)以其各自的優(yōu)點(diǎn)能夠?qū)﹄s質(zhì)結(jié)構(gòu)做出準(zhǔn)確的解析。

質(zhì)譜分辨率的提高增加了相對(duì)分子質(zhì)量信息的準(zhǔn)確性并可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)元素組成，同時(shí)利用質(zhì)譜內(nèi)置軟件或其他計(jì)算軟件 可計(jì)算出不同分子式得分高低。

質(zhì)譜分辨率提高也有區(qū)分不同同位素的功能，例如相對(duì)分子質(zhì)量為 500 左右的分子，只有分辨率達(dá)到 400000 才能將質(zhì)譜圖中的³⁴S和³⁷Cl兩種同位素峰分離開。

（2）核磁共振技術(shù)(NMＲ)

NMR 技術(shù)在雜質(zhì)定性和定量應(yīng)用中主要依賴于獲得雜質(zhì)單體，另外，在特殊雜質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立時(shí)對(duì)雜質(zhì)對(duì)照品的標(biāo)化可利用定量NMR進(jìn)行 。NMR技術(shù)同時(shí)也是一種質(zhì)量相關(guān)檢測(cè)技術(shù)，使用NMR技術(shù)求算校正因子進(jìn)而校正其他檢測(cè)器，可實(shí)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)進(jìn)程的監(jiān)控。NMR技術(shù)檢測(cè)靈敏度依賴著探針的性能。

因此，為了提高NMR檢測(cè)靈敏度，有研究者發(fā)明了致冷探針，這種探針只需微克級(jí)別的化合物單體就能實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物檢測(cè)，這使NMR檢測(cè)樣品消耗量實(shí)現(xiàn)了由毫克向微克的飛躍。同時(shí)在線的液相-核磁(LC-NMＲ)聯(lián)用技術(shù)也能實(shí)現(xiàn)藥物雜質(zhì)的快速結(jié)構(gòu)鑒定 。

5、新型的分析技術(shù)

隨著快速雜質(zhì)分析以及結(jié)構(gòu)鑒定準(zhǔn)確性的需要，也有一些方法被用于雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定，如藥物雜質(zhì)直接測(cè)定技術(shù) 、以分子印跡法(MIP)建立同類雜質(zhì)碎片數(shù)據(jù)庫以及單晶 X 線衍射技術(shù)等。

1、定量分析

由于基因毒性雜質(zhì)危險(xiǎn)性極大，美國 FDA 和歐洲藥品管理局(EMA)規(guī)定了毒理學(xué)擔(dān)憂閾值(TTC):人在長期用藥時(shí)，潛在毒性雜質(zhì)每日攝入量不能超過1.5 μg 。

根據(jù)上述規(guī)定，每天藥物服用劑量是 200mg，則毒性雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不應(yīng)超過7.5-×10^-6 ，因此對(duì)基因毒性雜質(zhì)定量分析需要痕量分析的方法。

常用的紫外檢測(cè)器最低能夠?qū)�質(zhì)量分?jǐn)?shù)5×10^-4的雜質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，但隨著 2D-HPLC的發(fā)明以及高靈敏度紫外檢測(cè)器的使用，藥物中痕量雜質(zhì)經(jīng)一維液相儀分離、固相萃取技術(shù)富集及二維液相儀高靈敏度檢測(cè)也能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。

但是，這種方法需要多次高濃度進(jìn)樣并不適合雜質(zhì)含量測(cè)定。

因此，質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)是建立基因毒性雜質(zhì)定量分析方法的重要前提。Kakasaheb等 對(duì)坎地沙坦中合成起始原料中的基因毒性雜質(zhì)利用 GC-MS 的方法進(jìn)行定量測(cè)定，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果能夠符合 ICH 規(guī)定的要求，該方法適用于上市藥品中基因毒性雜質(zhì)的含量測(cè)定。

在痕量的雜質(zhì)進(jìn)行方法建立過程中，樣品的前處理方式十分重要，微量的損失可能對(duì)結(jié)果造成極大的影響，Devenport 等創(chuàng)新性地在大氣壓條件下利用質(zhì)譜直接定量出模擬藥物中基因毒性雜質(zhì)，這種方法使樣品測(cè)定更加便捷，并可實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的高通量檢測(cè)。

2、毒性雜質(zhì)的確

2006 年，EMA 發(fā)布了遺傳毒性限度的指導(dǎo)原則，此后 ICH、FDA 以及我國的藥品審評(píng)中心也提出了對(duì)基因毒性雜質(zhì)的研究和控制方案。根據(jù)相關(guān)的指導(dǎo)原則，即使雜質(zhì)的含量在規(guī)定的定量要求以下也需要對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行毒性評(píng)估。

對(duì)化合物毒性評(píng)估是通過體外細(xì)菌毒性實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)的，同時(shí)指導(dǎo)原則推薦使用雜質(zhì)單體進(jìn)行研究。然而，藥物中的毒性雜質(zhì)都是微量或痕量存在的，通過制備等方法獲取雜質(zhì)單體耗時(shí)長且成本高。

為此，F(xiàn)DA 和其他公司共同開發(fā)了計(jì)算機(jī)軟件用于評(píng)估化合物的毒性。此軟件無需獲取單體，對(duì)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定后，即可使用毒性評(píng)估軟件評(píng)估雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)是否存在警示結(jié)構(gòu)。

在軟件方面，F(xiàn)DA 推薦使用MC4PC、MDL-QSAＲ 以及 Derk for Window 等進(jìn)行評(píng)估。為了對(duì)毒性得以準(zhǔn)確性的評(píng)估，每種軟件擁有特殊的算法和適用范圍：

MC4PC軟件是將待評(píng)估的結(jié)構(gòu)拆分成 2~3 個(gè)(非氫)原子的結(jié)構(gòu)碎片，再將這些碎片與已知毒性化合物碎片數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，對(duì)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)中的碎片做出了毒性累加得分并描繪結(jié)構(gòu)的分子特征，最終生成一個(gè)全面而且專業(yè)的報(bào)告評(píng)估雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)毒性。

雖然 MC4PC能夠從雜質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)角度評(píng)估藥物的毒性，但是其只能在已有的數(shù)據(jù)庫中搜索相同的碎片進(jìn)行比較，對(duì)多于一種未知碎片的結(jié)構(gòu)卻不能全面評(píng)估。

毒性化合物的研究結(jié)果表明毒性化合物結(jié)構(gòu)中都存在著親電子基團(tuán)或可被激活為親電子基團(tuán)的結(jié)構(gòu)，MDL-QSAＲ毒性評(píng)估軟件是基于化合物的毒性和該化合物的親電能力的相關(guān)性做出評(píng)估，這種軟件可計(jì)算出化合物結(jié)構(gòu)與其毒性的定量關(guān)系，同時(shí)可以預(yù)測(cè)體外細(xì)菌毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

然而，為了達(dá)到對(duì)已知結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)毒性的最準(zhǔn)確評(píng)估，使用 MDL-QSAＲ軟件時(shí)需尋找到最適合的模型用以計(jì)算，因此在該計(jì)算軟件提出后，有許多關(guān)于不同的數(shù)據(jù)模型以及對(duì)它們的評(píng)估的報(bào)道。

有些雜質(zhì)雖經(jīng)計(jì)算機(jī)評(píng)估結(jié)果為有警示結(jié)構(gòu)的潛在毒性雜質(zhì)，但由于評(píng)估軟件在計(jì)算過程中會(huì)過分評(píng)估雜質(zhì)的毒性，所以在判定藥物雜質(zhì)是否為毒性雜質(zhì)仍需要進(jìn)行體外細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)(Ames 實(shí)驗(yàn))或哺乳動(dòng)物細(xì)胞分析，F(xiàn)DA對(duì)該實(shí)驗(yàn)的過程給予詳細(xì)的說明。

3、控制方法

根據(jù) EMA 指導(dǎo)原則以及對(duì)指導(dǎo)原則問題解答，藥物中所有存在的化合物均應(yīng)該通過化合物毒性評(píng)估或符合指導(dǎo)原則的控制方法，同時(shí)為了確定潛在毒性雜質(zhì)是否為毒性雜質(zhì)需要進(jìn)行Ames實(shí)驗(yàn)。