在抗擊新型冠狀病毒疫情過(guò)程中，已于確診病例糞便中檢測(cè)到病毒核酸陽(yáng)性，國(guó)家衛(wèi)健委專(zhuān)家提示新冠肺炎有糞口傳播的可能性，并在某些特殊的條件下才發(fā)生氣溶膠傳播。針對(duì)這一問(wèn)題，生態(tài)環(huán)境部發(fā)布《關(guān)于做好新型冠狀病毒感染的肺炎疫情醫(yī)療污水和城鎮(zhèn)污水監(jiān)管工作的通知》，要求進(jìn)一步加強(qiáng)醫(yī)療污水和城鎮(zhèn)污水監(jiān)管工作，防止新型冠狀病毒通過(guò)污水?dāng)U散傳播。
為什么需要如此重視醫(yī)療污水和城鎮(zhèn)污水監(jiān)管工作呢？美國(guó)PM Gundy的研究團(tuán)隊(duì)曾在《Survival of Coronaviruses in Water and Wastewater》一文中指出，水體中的有機(jī)物和懸浮固體可以吸附冠狀病毒，為病毒的存活提供了保護(hù)。同時(shí)，從污水流向的我們不難看出，糞便最終排到了污水處理廠，這些可能攜帶新型冠狀病毒的廢水，在污水處理中形成攜帶病毒的氣溶膠，從而形成了氣溶膠傳播的環(huán)境，使污水處理人員成為感染風(fēng)險(xiǎn)較大的群體，對(duì)阻止疫情傳播有很大的影響。因此，醫(yī)療機(jī)構(gòu)、污水處理機(jī)構(gòu)及環(huán)境監(jiān)測(cè)部門(mén)，都是控制病毒通過(guò)污水傳播的關(guān)鍵。目前，為有效防止新型冠狀病毒通過(guò)糞便和污水?dāng)U散傳播，生態(tài)環(huán)境部門(mén)要求對(duì)要接收新型冠狀病毒感染的肺炎患者或疑似患者診療的定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)（醫(yī)院、衛(wèi)生院等）、相關(guān)臨時(shí)隔離場(chǎng)所及研究機(jī)構(gòu)，嚴(yán)格執(zhí)行《醫(yī)療機(jī)構(gòu)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》，并參照《醫(yī)院污水處理技術(shù)指南》、《醫(yī)院污水處理工程技術(shù)規(guī)范》和《新型冠狀病毒污染的醫(yī)療污水應(yīng)急處理技術(shù)方案（試行）》等有關(guān)要求，對(duì)污水和廢棄物進(jìn)行分類(lèi)收集和處理，確保穩(wěn)定達(dá)標(biāo)排放；同時(shí)，地方生態(tài)環(huán)境部門(mén)要督促城鎮(zhèn)污水處理廠切實(shí)加強(qiáng)消毒工作，結(jié)合實(shí)際，采取投加消毒劑或臭氧、紫外線消毒等措施，確保出水糞大腸菌群數(shù)指標(biāo)達(dá)到《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》要求。通過(guò)對(duì)比以上標(biāo)準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)，在這些污水處理過(guò)程中，糞大腸菌群數(shù)是評(píng)判污水處理是否合格的關(guān)鍵微生物指標(biāo)。研究表明，污水中糞大腸菌群數(shù)量與腸道致病菌數(shù)量存在相關(guān)關(guān)系，當(dāng)污水中糞大腸菌群數(shù)超過(guò)1174個(gè)/L時(shí)，即可在污水中檢出病原菌，因此將糞大腸菌群數(shù)作為特征指示性指標(biāo)對(duì)這些微生物進(jìn)行控制。根據(jù)檢測(cè)方法、應(yīng)用領(lǐng)域和污染情況的不同，各標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)糞大腸菌群數(shù)的限量也不同（表1）。目前，可用于檢測(cè)水體中糞大腸菌群數(shù)的方法有4種，分別是多管發(fā)酵法、膜過(guò)濾法和快速熒光檢測(cè)法、酶底物法，其中前三種認(rèn)可度較高，且使用較廣泛。膜過(guò)濾法是目前最常用于水體中糞大腸菌群數(shù)檢測(cè)的一種標(biāo)準(zhǔn)方法，也是《新型冠狀病毒污染的醫(yī)療污水應(yīng)急處理技術(shù)方案（試行）》中的指導(dǎo)方法，可于地表水、地下水、生活污水、工業(yè)廢水及醫(yī)療污水等樣本的檢測(cè)。
該方法使樣品通過(guò)孔徑為0.45μm的濾膜過(guò)濾，細(xì)菌被截留在濾膜上，然后將濾膜置于MFC選擇性培養(yǎng)基上，在特定的溫度(44.5℃)下培養(yǎng)24h，膽鹽三號(hào)可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，糞大腸菌群能生長(zhǎng)并發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸使指示劑變色，通過(guò)顏色判斷是否產(chǎn)酸，并通過(guò)對(duì)呈藍(lán)色或藍(lán)綠色的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而測(cè)定樣品中糞大腸菌群濃度。膜過(guò)濾法的關(guān)鍵在于樣品前處理，需借助抽濾裝置才可完成，使微生物被截留在無(wú)菌濾膜上，并通過(guò)物理的方式進(jìn)行富集，以保證糞大腸菌以菌落形態(tài)被檢出。目前，市面上已有較為成熟、有效的的水中膜過(guò)濾裝置，可用于水體中微生物前處理操作。
DW-28型 水中微生物膜過(guò)濾裝置
- 專(zhuān)為水質(zhì)樣品前處理、富集等操作設(shè)計(jì)；
- 結(jié)構(gòu)精巧，配合精密抽濾泵，保證良好的抽濾效果；
- 不銹鋼材質(zhì)，可高溫高壓滅菌，避免交叉污染；
多管發(fā)酵法又稱最大可能數(shù)（most probable number，MPN）法或稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)法，該方法是用于檢測(cè)地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中糞大腸菌群的測(cè)定中糞大腸菌群數(shù)的一種標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法是一種基于泊松分布的間接計(jì)數(shù)法，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，根據(jù)一定體積不同稀釋度樣品經(jīng)培養(yǎng)后產(chǎn)生的目標(biāo)微生物陽(yáng)性數(shù)，查表估算一定體積樣品中目標(biāo)微生物存在的數(shù)量（即單位體積存在目標(biāo)微生物的最大可能數(shù)）。采用多管發(fā)酵法時(shí)，先將樣品加入含乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的試管中，37℃初發(fā)酵富集培養(yǎng)，大腸菌群在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，產(chǎn)生的酸使溴甲酚紫指示劑由紫色變?yōu)辄S色，產(chǎn)生的氣體進(jìn)入倒管（杜氏小管）中，指示產(chǎn)氣。然后再44.5℃復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基中的膽鹽三號(hào)可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，最后產(chǎn)氣的細(xì)菌確定為是糞大腸菌群。最后通過(guò)查MPN表，即可得出糞大腸菌群濃度值。該方法在操作過(guò)程中，根據(jù)樣品檢出限的不同，可選擇12管法（檢出限為3MPN/L）或15管法（檢出限為3MPN/L）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因此需要大量使用試管和液體培養(yǎng)基（每個(gè)樣品需準(zhǔn)備12或15支試管）。若檢測(cè)樣品量較大時(shí)，建議可采用培養(yǎng)基分液器來(lái)降低工作量。
DW-9型 微生物試劑分液器
- 可用于生理鹽水、液體及半固體培養(yǎng)基自動(dòng)分裝；
- 1L溶液分裝到100個(gè)MPN法試管中，最快僅需2分鐘；
- 微電腦系統(tǒng)與精密泵體聯(lián)合控制，分裝精度高；
- 分裝量、分裝速度、分裝時(shí)間、停頓時(shí)間、分裝次數(shù)等參數(shù)可自由設(shè)定。
采用自動(dòng)微生物試劑分液器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)用品準(zhǔn)備，不僅能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的連續(xù)分裝，還可在保證進(jìn)度的同時(shí)，大大降低工作量。
快速熒光檢測(cè)法是一種利用ATP熒光原理與微生物特性相結(jié)合的快速檢測(cè)方法，雖然該方法暫未被納入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，但由于其操作方便，檢測(cè)與培養(yǎng)時(shí)間短（僅為膜過(guò)濾法、多管發(fā)酵法的1/3），目前被很多大型企業(yè)作為內(nèi)部微生物自檢的一種重要手段。通過(guò)與對(duì)應(yīng)的采樣、增菌拭子配合使用，可快速檢測(cè)水體中糞大腸菌群數(shù)量。快速熒光檢測(cè)法是在熒光素酶（lueiferase）和Mg2+的作用下，熒光素（lueiferin）與ATP發(fā)生腺苷�；磻�(yīng)后被活化，活化的熒光素與熒光素酶相結(jié)合，形成了熒光素-AMP復(fù)合體焦磷酸（PPi）。該復(fù)合物在氧化作用下，產(chǎn)生熒光信號(hào)。通過(guò)ATP檢測(cè)液檢測(cè)微生物ATP的發(fā)光量，達(dá)到檢測(cè)細(xì)菌的目的。該方法現(xiàn)已獲得AOAC研究機(jī)構(gòu)的檢測(cè)方法性能擔(dān)保認(rèn)證。目前，杭州大微已開(kāi)發(fā)了DW-ES800型微生物實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)基于ATP熒光快速檢測(cè)法，采用雙模塊設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)水體中糞大腸菌群、大腸菌群、大腸桿菌、細(xì)菌總數(shù)等多種微生物的檢測(cè)和計(jì)數(shù)。
DW-ES800 微生物實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)
- 耗時(shí)短：培養(yǎng)時(shí)間短（定性8小時(shí)，定量1~8小時(shí)），檢測(cè)時(shí)間僅需15秒
- 范圍廣：細(xì)菌總數(shù)、大腸桿菌、總大腸菌群、糞大腸菌群等多種微生物
- 效率高：雙培養(yǎng)通道，可同時(shí)培養(yǎng)不同溫度微生物
- 易操作：五步即可完成（增菌拭子采樣→培養(yǎng)→轉(zhuǎn)移→檢測(cè)拭子激活→檢測(cè)）
酶底物法是檢測(cè)水體中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的一種標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法是利用在特定溫度下培養(yǎng)特定的時(shí)間，總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌能產(chǎn)生特定的β-半乳糖苷酶將選擇性培養(yǎng)基中的無(wú)色底物鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）分解為鄰硝基酚（ONP），呈黃色反應(yīng)；且大腸埃希氏菌同時(shí)又能產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶將選擇性培養(yǎng)基中的4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）分解為4-甲基傘形酮，在紫外燈照射下呈熒光反應(yīng)。統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性反應(yīng)出現(xiàn)數(shù)量，查MPN表，再除以接種樣品的稀釋度。計(jì)算相應(yīng)水樣中總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌的濃度值。由于操作起來(lái)較為繁瑣，工作量巨大，故在日常檢測(cè)中很少被使用。
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