1

接種

常用的接種方法有以下幾種：

①劃線接種；這是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來(lái)回直線形的移動(dòng)，就可達(dá)到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。

②三點(diǎn)接種；在研究霉菌形態(tài)時(shí)常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點(diǎn)，讓它各自獨(dú)立形成菌落后，來(lái)觀察、研究它們的形態(tài)。除三點(diǎn)外，也有一點(diǎn)或多點(diǎn)進(jìn)行接種的。

③穿刺接種；在保藏厭氧菌種或研究微生物的動(dòng)力時(shí)常采用此法。做穿刺接種時(shí)，用的接種工具是接種針。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺，如某細(xì)菌具有鞭毛而能運(yùn)動(dòng)，則在穿刺線周?chē)�能夠生長(zhǎng)。

④澆混接種；該法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后再倒入冷卻至45°c左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達(dá)到稀釋的目的。待平板凝固之后，置合適溫度下培養(yǎng)，就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物菌落。

⑤涂布接種；與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作來(lái)回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物的菌落。

⑥液體接種；從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，倒入液體培養(yǎng)基中，或者從液體培養(yǎng)物中，用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)物中將菌液移至固體培養(yǎng)基中，都可稱為液體接種。

⑦注射接種；該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，如人或其它動(dòng)物中，常見(jiàn)的疫苗預(yù)防接種，就是用注射接種，接入人體，來(lái)預(yù)防某些疾病。

⑧活體接種；活體接種是專門(mén)用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法，因?yàn)椴《颈仨毥臃N于活的生物體內(nèi)才能生長(zhǎng)繁殖。所用的活體可以是整個(gè)動(dòng)物；也可以是某個(gè)離體活組織，例如猴腎等；也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。

2

無(wú)菌操作

1

傾注平板法

2

涂布平板法

3

平板劃線法

4

富集培養(yǎng)法

5

厭氧法

1

好氧培養(yǎng)

2

厭氧培養(yǎng)

1

形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察

①細(xì)菌的培養(yǎng)特征包括以下內(nèi)容：在固體培養(yǎng)基上，觀察菌落大小、形態(tài)、顏色（色素是水溶性還是脂溶性）、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等；在液體培養(yǎng)中的表面生長(zhǎng)情況（菌膜、環(huán)）混濁度及沉淀等；半固體培養(yǎng)基穿刺接種觀察運(yùn)動(dòng)、擴(kuò)散情況。

②常見(jiàn)的細(xì)菌的培養(yǎng)特征：點(diǎn)狀、圓形、絲狀、不規(guī)則形、假根狀、紡錘狀、扁平、隆起、凸起、墊狀、臍狀、邊緣整齊、波狀、裂片狀、嚙蝕狀、絲狀、卷發(fā)狀、絲線狀、刺毛狀、串珠狀、疏展?fàn)�、�?shù)根狀、假根狀、絲狀、串珠狀、乳頭狀、絨毛狀、樹(shù)根狀、量杯狀、蘿卜狀、漏斗狀、囊狀、層狀、絮狀、環(huán)狀、蹼狀、膜狀。

③霉菌酵母菌的培養(yǎng)特征：大多數(shù)酵母菌沒(méi)有絲狀體，在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和細(xì)菌的很相似，只是比細(xì)菌菌落大且厚。
液體培養(yǎng)也和細(xì)菌相似，有均勻生長(zhǎng)、沉淀或在液面形成菌膜。

霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長(zhǎng)，在條件適宜的培養(yǎng)基里，菌絲無(wú)限伸長(zhǎng)沿培養(yǎng)基表面蔓延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無(wú)色，基內(nèi)菌絲褐色。霉菌在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。

2

生理生化試驗(yàn)

微生物檢驗(yàn)中常用的生化反應(yīng)有：

①糖酵解試驗(yàn)

不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣�？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗(yàn)。

試驗(yàn)方法：以無(wú)菌操作，用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基管，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。接種后，置36±1.0℃培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，檢視培養(yǎng)基顏色有無(wú)改變（產(chǎn)酸），小倒管中有無(wú)氣泡，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽(yáng)性，若為半固體培養(yǎng)基，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無(wú)微小氣泡，有時(shí)還可看出接種菌有無(wú)動(dòng)力，若有動(dòng)力、培養(yǎng)物可呈彌散生長(zhǎng)。

本試驗(yàn)主要是檢查細(xì)菌對(duì)各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力，從而進(jìn)行各種細(xì)菌的鑒別，因而每次試驗(yàn)，常需同時(shí)接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫，溴百里藍(lán)和an-drade指示劑。

②淀粉水解試驗(yàn)

某些細(xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。

試驗(yàn)方法：以18～24h的純培養(yǎng)物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個(gè)平板可分區(qū)接種，試驗(yàn)數(shù)種培養(yǎng)物）或直接移種于淀粉肉湯中，于36±1℃培養(yǎng)24～48h，或于20℃培養(yǎng)5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。立即檢視結(jié)果，陽(yáng)性反應(yīng)（淀粉被分解）為瓊脂。培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培養(yǎng)物周?chē)�出現(xiàn)無(wú)色透明環(huán)、或肉湯顏色無(wú)變化。陰性反應(yīng)則無(wú)透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色。

淀粉水解系逐步進(jìn)行的過(guò)程，因而試驗(yàn)結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)基含有淀粉量和ph等均有一定關(guān)系。培養(yǎng)基ph必須為中性或微酸性，以ph7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時(shí)制備為妥。

③v-p試驗(yàn)

某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱v－p（+）反應(yīng)。

試驗(yàn)方法：（1）o’meara氏法：將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1℃培養(yǎng)48h，培養(yǎng)液1ml加o’meara試劑（加有0.3%肌酸creatine或肌酸酐creatinine的40%氫氧化鈉水溶液）1ml，搖動(dòng)試管1～2min，靜置于室溫或36±1℃恒溫箱，若4h內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅、即判定為陰性。亦有主張?jiān)?8~50℃水浴放置2h后判定結(jié)果者。

（2）barritt氏法：將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1℃培養(yǎng)4天、培養(yǎng)液2.5ml先加入5°cα萘酚（2-na-phthol）純酒精溶液0.6ml，再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml，搖動(dòng)2～5min，陽(yáng)性菌常立即呈現(xiàn)紅色，若無(wú)紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或36±1℃恒溫箱，如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色、可判定為陰性。

（3）快速法：將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán)，乳化接種于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動(dòng)后放置5min，判定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用。

本試驗(yàn)一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細(xì)菌時(shí)，通用培養(yǎng)基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生，故應(yīng)省去或以氯化鈉代替。

④甲基紅（methyl red）試驗(yàn)

腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過(guò)程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基ph值下降至ph4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。

試驗(yàn)方法：挑取新的待試純培養(yǎng)物少許，接種于通用培養(yǎng)基，培養(yǎng)于36±1℃或30℃（以30℃較好）3～5天，從第二天起，每日取培養(yǎng)液1ml，加甲基紅指示劑1～2滴，陽(yáng)性呈鮮紅色，弱陽(yáng)性呈淡紅色，陰性為黃色。迄至發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性或至第5天仍為陰性、即可判定結(jié)果。

甲基紅為酸性指示劑，ph范圍為4.4～6.0，其pk值為5.0。故在ph5.0以下，隨酸度而增強(qiáng)黃色，在ph5.0以上，則隨堿度而增強(qiáng)黃色，在ph5.0或上下接近時(shí)，可能變色不夠明顯，此時(shí)應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，重復(fù)試驗(yàn)。

⑤靛基質(zhì)（imdole）試驗(yàn)

某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來(lái)。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。

試驗(yàn)方法：將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基管，于36±1℃培養(yǎng)24h時(shí)后，取約2ml培養(yǎng)液，加入kovacs氏試劑2～3滴，輕搖試管，呈紅色為陽(yáng)性，或先加少量乙醚或二甲苯，搖動(dòng)試管以提取和濃縮靛基質(zhì)，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入kovacs氏試劑數(shù)滴，在接觸面呈紅色，即為陽(yáng)性。

實(shí)驗(yàn)證明靛基質(zhì)試劑可與17種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，若先用二甲苯或乙醚等進(jìn)行提取，再加試劑，則只有靛基質(zhì)或5-甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色，因而結(jié)果更為可靠。

⑥硝酸鹽（nitrate）還原試驗(yàn)

有些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮?dú)獾�。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗(yàn)。

試驗(yàn)方法：臨試前將試劑的a（磺胺酸冰醋酸溶液）和b（α－萘胺乙醇溶液）試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加于液體培養(yǎng)物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面，立即或于10min內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為試驗(yàn)陽(yáng)性，若無(wú)紅色出現(xiàn)則為陰性。用α-萘胺進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，陽(yáng)性紅色消退很快、故加入后應(yīng)立即判定結(jié)果。進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對(duì)照。α-萘胺具有致癌性、故使用時(shí)應(yīng)加注意。

⑦明膠（gelatin）液化試驗(yàn)

有些細(xì)菌具有明膠酶（亦稱類蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進(jìn)一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化。

試驗(yàn)方法：挑取18～24h待試菌培養(yǎng)物，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點(diǎn)種于平板培養(yǎng)基。于20～22℃培養(yǎng)7～14天。明膠高層亦可培養(yǎng)于36±1℃。每天觀察結(jié)果，若因培養(yǎng)溫度高而使明膠本身液化時(shí)應(yīng)不加搖動(dòng)、靜置冰箱中待其凝固后、再觀察其是否被細(xì)菌液化，如確被液化，即為試驗(yàn)陽(yáng)性。平板試驗(yàn)結(jié)果的觀察為在培養(yǎng)基平板點(diǎn)種的菌落上滴加試劑，若為陽(yáng)性，10～20min后，菌落周?chē)鷳?yīng)出現(xiàn)清晰帶環(huán)。否則為陰性。

⑧尿素酶（urease）試驗(yàn)

有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因?yàn)椴徽摰孜锬蛩厥欠翊嬖�，�?xì)菌均能合成此酶。其活性最適ph為7.0。

試驗(yàn)方法：挑取18～24h待試菌培養(yǎng)物大量接種于液體培養(yǎng)基管中，搖均，于36±1℃培養(yǎng)10，60和120min，分別觀察結(jié)果�；蛲坎疾⒋┐探臃N于瓊脂斜面，不要到達(dá)底部，留底部作變色對(duì)照。培養(yǎng)2，4和24h分別觀察結(jié)果，如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定，變?yōu)榉奂t色為陽(yáng)性。

⑨氧化酶（oxidase）試驗(yàn)

氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶，為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，氧化酶先使細(xì)胞色素c氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素c再使對(duì)苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。

試驗(yàn)方法：在瓊脂斜面培養(yǎng)物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1～2滴，陽(yáng)性者kovacs氏試劑呈粉紅色～深紫色，ewing氏改進(jìn)試劑呈藍(lán)色。陰性者無(wú)顏色改變。應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果。

⑩硫化氫（H2S）試驗(yàn)

有些細(xì)菌可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。

試驗(yàn)方法：在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養(yǎng)基中，沿管壁穿刺接種，于36±1℃培養(yǎng)24～28h，培養(yǎng)基呈黑色為陽(yáng)性。陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至6天。也可用醋酸鉛紙條法：將待試菌接種于一般營(yíng)養(yǎng)肉湯，再將醋酸鉛紙條懸掛于培養(yǎng)基上空，以不會(huì)被濺濕為適度；用管塞壓住置36±1℃培養(yǎng)1～6天。紙條變黑為陽(yáng)性。

⑪三糖鐵（TSI）瓊脂試驗(yàn)

試驗(yàn)方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置36±1℃培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。

本試驗(yàn)可同時(shí)觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來(lái)又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。

⑫硫化氫-靛基質(zhì)-動(dòng)力（sim）瓊脂試驗(yàn)

試驗(yàn)方法：以接種針挑取菌落或純養(yǎng)物穿刺接種約1/2深度，置36±1℃培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。培養(yǎng)物呈現(xiàn)黑色為硫化氫陽(yáng)性，混濁或沿穿刺線向外生長(zhǎng)為有動(dòng)力，然后加kovacs氏試劑數(shù)滴于培養(yǎng)表面，靜置10min，若試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽(yáng)性。培養(yǎng)基未接種的下部，可作為對(duì)照。

本試驗(yàn)用于腸桿菌科細(xì)菌初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著提高篩選功效。

3

血清學(xué)試驗(yàn)

血清學(xué)反應(yīng)的一般特點(diǎn)：

①抗原體的結(jié)合具有特異性，當(dāng)有共同抗原體存在時(shí)，會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。
②抗原體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，這種結(jié)合雖相當(dāng)穩(wěn)定，但是可逆的。
③抗原體的結(jié)合是按一定比例進(jìn)行的，只有比例適當(dāng)時(shí)，才能出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。
④血清學(xué)反應(yīng)大體分為兩個(gè)階段進(jìn)行，但其間無(wú)嚴(yán)格界限。第一階段為抗原體特異性結(jié)合階段，反應(yīng)速度很快，只需幾秒至幾分鐘反應(yīng)即可完畢，但不出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)現(xiàn)象。第二階段為抗原體反應(yīng)的可見(jiàn)階段，表現(xiàn)為凝集、沉淀、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)等。反應(yīng)速度慢，需幾分、幾十分以至更長(zhǎng)時(shí)間。而且，在第二階段反應(yīng)中，電解質(zhì)、ph、溫度等環(huán)境因素的變化，都直接影響血清學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。